Fluorórás készletek: Gyakorlati útmutató az érzékeny mintamennyiségi meghatározáshoz

A molekuláris biológiai laboratóriumokban a DNS, RNS vagy fehérje egy fluorométeres készlettel lehet mérni, amely fluoreszcenciát használ. Ezek a vizsgálatok olyan festékeken alapulnak, amelyek nagyobb jelet adnak egy adott célponthoz kötve, nem pedig a teljes UV-elnyelőerőt mérték. Ez a szelektivitás előnyös, ha a minták hígottak, kis térfogatúak, vagy más anyagokkal szennyezettek, amelyek akadályozhatják az elnyelőképesség mérését.

A teljes munkafolyamat általában tartalmaz egy tesztreagenset, hígítópuffert, szabványokat, tesztcsöveket vagy tesztlemezeket, valamint egy az eljáráshoz megfelelő fluorométert. Az elemzés skálája kulcsfontosságú a megbízható eredmények eléréséhez, valamint a szabványok kikészítésének következetessége, a reagensek nem megfelelő fényhatása elleni védelem és az összes hígítás pontos rögzítése szempontjából.

A fluorométer készlet tartalmazza az összes szükséges anyagot és felszerelést a fluoreszcencia méréséhez

A fluorométer vizsgálati készletek többsége rendkívül koncentrált fluoreszkáló festékből, egy pufferből és referencia szabványokból áll. Csövek, protokollkártyák vagy műszerspecifikus tesztbeállítások is tartalmaznak néhány készletben.

A festékkémia lesz a meghatározó tényező, hogy az vizsgálat mit fog mérni. A szelektív dsDNS mennyiségi meghatározást egy kétszálas DNS-készleten kell végezni. Az RNS, az egyszálú DNS és a fehérjevizsgálatok különböző kötőkémiai kémiákon alapulnak, és nem felcserélhetők.

Például a kereskedelmi dsDNS készletek tartalmazhatnak koncentrált tesztreagenst, hígító puffert és előre hígított DNS szabványokat. Más rendszerek is rendelkezésre állnak, amelyek kompatibilisek az egycsöves vagy mikropláda fluorométerekkel kompatibilisek, megfelelő gerjesztési és emissziós hullámhosszokkal.

Néha a fluoreszcencia jobb, mint az UV-elnyelő

A nukleinsav-koncentráció becslése UV spektrofotometriával a 260 nm-es absorptancián alapul. Gyors és hasznos a tisztasági arányok szempontjából, de sók, szabad nukleotidok, fehérjék, RNS, DNS és más szerves vegyületek is elnyelő jelet eredményezhetnek.

A fluoreszkáló vizsgálatokat úgy alakították ki, hogy specifikusabbak legyenek egy kiválasztott analitokra. Ez segíthet egy alacsony koncentrációjú vagy minta pontosságának javításában, amely potenciális szennyezőanyagokat tartalmazhat. A fluorometrikus kvantifikálás így érzékenyebb és szelektívebb lehet, mint az UV elnyelő a specifikus DNS, RNS vagy fehérje mérésében.

Mindkét módszer kombinálható. A fluoreszcencia egy adott célpont koncentrációjának mérésére használható, az UV elnyelő képesség pedig általánosabb tisztaságmérést biztosít.

Válaszd ki az analitok és a mérési tartomány készletét.

Többféle gyakori fluorométer-készlet létezik, például:

• Magas érzékenységű dsDNS vizsgálatok
• Széles tartományú dsDNS vizsgálatok
• RNS-vizsgálatok
• ssDNS vizsgálatok
• Fehérjevizsgálatok
• RNS-minőségi vizsgálatok

Alacsony koncentrációjú kivonatok és előkészített szekvenálási könyvtárak magas érzékenységű vizsgálattal kimutathatók. A szűk tartományú vizsgálatok jobbak magas koncentrációjú mintákhoz. A validált tartományon kívüli mintákat hígítani kell, különben az eredmények kevésbé lehetnek megbízhatóak.

A magas érzékenységű és széles tartományú készletek mennyiségi tartományai eltérhetnek, és ugyanazra az analitóra vonatkoznak. Ezért az elemzést a várható koncentráció alapján kell választani, nem csak a minta neve alapján.

A készletnek kompatibilisnek kell lennie a fluorométerrel is. Ellenőrizze az ingeresztési és kibocsátási csatornákat, cső/lemez formátumot, mintamennyiséget, kalibrációs módszert és programozott tesztopciókat. Bizonyos protokollokat előre programozhatnak egyes fluorométerekbe dsDNA, RNS és ssDNS elemzéshez, másokat egyedi programozhatnak.

Írd meg a Sample Volume és Áteresztő definíciókat

A kis térfogat hasznos, ha nehéz mintákat szerezni, vagy tartósítást igényel a későbbi kísérletekhez. Néhány mikroliter mintavétel szükséges néhány munkagépi fluorometrikus rendszerben, de általában a mintát nagyobb mennyiségű munkaoldatba helyezik.

Az áteresztőképesség is fontos tényező. Alkalmi mérésekhez és kis adagokhoz egy csöves fluorométer is megfelelő lehet. Előnyben részesíthető lehet egy olyan műszer vagy mikrolemez munkafolyamat, amely több kivonási mintát vagy több szekvenálási könyvtárat képes feldolgozni, olyan laboratóriumokban, ahol sok minta van.

Nem minden hangszer a legpraktikusabb. Egy jó rendszer minimalizálja az ismétlődő pipetezést, megkönnyíti a rendszeres előkészítést, és egyeztetnie kell a laboratórium által rendszeresen kezelt minták tényleges mennyiségének.

Következetes vizsgálati munkafolyamat követése

Az alábbiakban egy szabványos fluorométer-készlet protokoll található:

• A. A működő megoldás készen áll. Működő megoldás születik.
• A szükséges szabványok megalkotása
• Minden ismeretlen mintavétel hozzáadása
• Alaposan kevered mintákat és standardokat
• Inkubálás a megadott időn át
• A nem megfelelő fény elleni reakciók megelőzése
• Egy vonalzó segítségével mérjük az agy szélességét és hosszát.9. Az agy helyes mérése egy vonalzóval.
• Minták hígítási faktorainak alkalmazása

Kalibrált pipettákat használjunk, hogy szabványokat és mintákat ugyanúgy készítsünk és használjunk. Ha alacsony térfogatú pipetelési lépést végeznek, egy kis térfogatbeli hiba jelentős különbséget okozhat a végső koncentrációban.

Az inkubációhoz szükséges idő is fontos. Ha az elején egy mintát veszünk, majd egy másikat sokkal később veszünk, az felesleges eltéréseket okozhat. Néhány vizsgálat érzékeny a szabványok és a minták közötti hőmérsékletkülönbségre is.

Használj megfelelő szabványokat, üres helyeket és replikációkat

Szabványokat használnak az analit mennyiségének és a fluoreszcencia intenzitásának összekapcsolására. Alaposan össze kell keverni, megfelelően címkézni, és távol kell tartani a szennyeződéstől.

Amikor ismeretlen mintát helyeznek be egy üres helyre, a mért jel a reagens, a puffer, a cső vagy a háttérminta-mátrix miatt történik. A replikált mérések hasznosak, ha a minta értékes, a pontos koncentráció közel van az teszt határához, vagy egy váratlan eredmény befolyásolná a költséges lefelé vezető folyamatot.

Ha vannak duplikált olvasmányok, amelyek eltérnek egymással, ne számold ki egyszerűen a két olvasmány átlagát. Ellenőrizze a pipetálás pontosságát, a minták keverését, buborékok jelenlétét, a csövek tisztaságát, az inkubációs időt, a hőmérsékletet és a kiválasztott mérési tartományt.

A férfiaknak és nőknek eltérő módszerei vannak a fájdalom mérésére

A megbízhatatlan fluorometrikus eredmények gyakori oka a következők:

• A célpont rossz vizsgálatának kiválasztása
• Nem megfelelő érzékenységi tartomány kiválasztása
• Nem használjuk a megfelelő tárolót tárolásra és előkészítésre
• Következetlen mintamennyiségek hozzáadása
• A szennyezőanyagok jelenléte a szabványokban vagy működő oldatban.
• A csapda, amely buborékokat hagy optikai úton.
• Karcolt vagy összeegyeztethetetlen csövek használata tilos. Karcolt vagy összeegyeztethetetlen csövek nem engedélyezettek.
• Túlzott fényérzékeny reagenseknek való kitettség
• Ne vegyük figyelembe, hogy a példányban lévő sejtek száma hígítás miatt csökken.
• Az eszköz használata a validált eszköz hatótávolságán kívül.

A koncentrált minták szennyezhetik a pipettákat vagy munkaterületeket is, és hatással lehetnek a jövőbeli alacsony koncentrációjú mintákra. Ezt minimalizálják friss tippek, tiszta munkafelületek és racionális mintaszekvenciá.

Kapcsold össze a Mérést a Downstream munkafolyamathoz úgy, hogy áthúzd a Downstream Workflow-ba

A fluorométer készleteket gyakran alkalmazzák PCR, qPCR, klónozás, szekvenálási könyvtár előkészítése, elektroforézis, transzfekció és más, kontrollált mintabevitést igénylő munkafolyamatok előtt.

A kvantifikáció fontos a minták normalizálásában, az extrakcióhozamok összehasonlításában, és a következetes reakció bemenetének megszerzéséhez. Az RNS vizsgálatokat (fluoreszcencia alapú) más alkalmazások, például az RT-PCR és cDNA-könyvtár előkészítése előtt alkalmazzák; A DNS kvantifikációt különféle későbbi alkalmazásokban alkalmazzák, mint például PCR, klónozás, transzfekció és következő generációs szekvenálás.

Ezért a készlet kiválasztásának a mérés után hozott döntés alapján kell kialakítania. Széles tartományú vizsgálat használható egy rutinszerű kivonási ellenőrzés során, és egy érzékenyebb vizsgálat alacsony bemenetű szekvenálási munkához.

Mindig tartsd meg és kezeld megfelelően a reagencseket

A fluoreszkáló reagencsek lehetnek érzékenyek a fényre, hőmérsékletre és kezelhetőségre. Tárold, melegíts, keverd és lejárd a készlet utasításai szerint. Nem minden fluoreszkáló festék fagyasztható, szobahőmérsékleten tárolható vagy laboratóriumi fénynek lehet kitéve.

Világosan jelöld meg a működő megoldásokat, és felejtsd el feljegyezni a készítés dátumát. Mielőtt gyanítanád, hogy az eredeti minták megváltoztak, ellenőrizd a reagensek életkorát, reagenstárolási előzményeit, szabványokat, pipettákat, műszerbeállítást, hőmérsékletet és csövek kompatibilitást.

Következtetés

A fluorórás készletek érzékenyek és szelektívek a DNS, RNS vagy fehérje mennyiségi meghatározására, különösen értékes vagy hígított mintákban. A megbízható méréshez szükséges, hogy az analit és koncentrációs tartomány megfelelő legyen, megfelelő fluorométer használatát, a szabványok következetes előkészítését és az egész folyamat kontrollját követeli.

Nem az a készlet, amelynek a legalacsonyabb kiállított észlelési határa van, a legjobb készlet. Ez az, amely megfelel a laboratórium mintatípusának, áteresztőképességének, későbbi alkalmazásának és minőségellenőrzési követelményének.

GYIK

1. kérdés. Milyen alkalmazásai a fluorométer készletnek?

Számos különböző készlet áll rendelkezésre dsDNA, ssDNS, RNS és néhány RNS minőségvizsgálatra. A szűrési módszer kémiájának megfelelő kell legyen a célponthoz.

K2. Melyik a hatékonyabb, a fluorórás készletek vagy az UV módszerek?

Általában specifikusabbak és érzékenyebbek egy adott analitásra. Az UV-elnyelőség továbbra is érvényesnek tekinthető félfinal tisztasági teszt és a minta teljes tisztaságának mérésekor.

K3. Mennyi mintára van szükséged?

A térfogatok különböző tesztekhez és műszerekhez eltérőek lesznek! Valóban, számos munkaasztali rendszer létezik, amelyek mindössze néhány mikroliter eredeti mintát igényelnek.

4. kérdés. Milyen reagens van a DNS RNS vizsgálatához?

Általában nem szelektíven. A rutin alkalmazásban érdemes lehet mérni a DNS és/vagy RNS tartalmát, így egy vizsgálat lehet egy-egyre vagy mindkettőre specifikus.

K5. Mi az oka a különböző replikációk eredményei változásának?

Ezeket gyakran pipetolási hiba, nem megfelelő keverés, buborék, szennyeződés, hőmérséklet vagy mérési tartomány hibája okozza.