Nagy érzékenységű fluorométer használata megbízható NGS könyvtár mennyiségi meghatározásához

Sajnos egy alacsony bemenetű NGS könyvtár úgy tűnhet, hogy készen áll a szekvenálásra, amikor még mindig nincs elegendő használható DNS a következő lépéshez. Egy bizonytalan koncentrációs eredmény helytelen hígításhoz vagy felesleges újrateszteléshez vezethet ebben a ponton. A szekvenálási labor számára a leghasznosabb kérdés tehát az, hogy a kvantifikációs módszerük megbízható eredményt ad-e a könyvtáraik által elért koncentrációs szinteken.

Ebben a cikkben a Longlight QFluo-1 fluorométeréről fogunk beszélni. A munkafolyamatban azt használják, hogy a kutató könyvtárelőkészítési és/vagy normalizációs döntése előtt nukleinsav-koncentrációt kapjon.

Határozd meg, mire valók a mérés

A fluorométer értékelése előtt először határozzuk meg a következő felhasználását. Az eredményt arra használják-e, hogy megállapítsák, szükséges-e egy könyvtár további koncentrációra, hígításra vagy arra, hogy több könyvtárat normalizáljanak egy közös bemenetre? Minden döntésben eltérő szintek vannak a bizonytalanság tűrésére.

Dokumentálja a laboratóriumban általában tapasztalható koncentrációtartományt; ez magában foglalja azokat a mintákat, amelyek közel vannak a tartomány alsó határához. Ha csak a tiszta DNS-t bizonyítják, az nem árul el sokat a vásárláshoz vezető problémás könyvtárakról. Válassz reprezentáló mintákat, határozd meg az elfogadási kritériumokat az eredmények összehasonlítása előtt.

Értsd meg Mi Magas érzékenységi eszközök QFluo-1 esetén

A fluoreszcencia vizsgálat egy olyan reagencentet foglal magában, amelyet úgy választanak, hogy képes jelet adni egy célpontból, például kettős szálú DNS-ből. Ezt a jelet a fluorométer olvasza, és egy teszt-specifikus kalibrációt alkalmaznak a koncentráció jelentésére. A műszer érzékenysége önmagában nem határozza meg az összes DNS, RNS vagy fehérje teszt teljesítményét – az tesztreagens a mérés része.

Longlight szerint a QFluo-1 érzékenysége 0,01 ng/μL a dsDNS kimutathatósága szempontjából, és képes 1-től 20 μl-ig terjedő mintákat is érzékelni. Termékspecifikációiban azt is említi, hogy két pontban kalibrálható, és a mérési idő nem halad több három másodpercnél mintánként. Ezeket a számokat használd specifikációként, amelyet a laborod használni fog, az anszta- és mintatípusok használatakor.

Válaszd ki az elemzést, mielőtt értelmeznéd a számot

Egy laboratórium meghatározhatja a dsDNS, RNS és fehérjék mennyiségét egyetlen műszerben, de egyiket sem szabad felcserélhető tesztként tekinteni. Válasszon megfelelő analitvizsgálatot, és vizsgáljuk meg annak működési tartományát, mintaelőkészítését és szabványait.

Az NGS könyvtár értékelésekor fontold meg, hogy egy dsDNA vizsgálat képes választ adni-e az adott QC lépés adott kérdésére. Longlight QF számszerűsítő vizsgálati készlet mind a feltekeredett (dsDNS), mind az RNS) szelektív kvantifikációjára vezetik be, és QFluo-1-mel kompatibilisnek jelölték. A QFluo-1-et "nyílt rendszerként" is bejelentik különböző fluoreszcencia vizsgálatokhoz, azonban az alkalmasságot vizsgálatonként kell meghatározni.

Kicsi Minták: Védelem előkészítés közben

Az alacsony bemenetű könyvtárak gyakran korlátozott mennyiségű anyagot tartalmaznak, ezért fontos, hogy minimalizáljuk a mintafogyasztást a kvantifikálás során. Határozzák meg az elemzéshez szükséges mintamennyiséget, és számolják ki a további feldolgozásra megmaradt minta mennyiségét. A QFluo-1 meghatározott mintabemenete 1-20 μL, ami a laboratórium számára számos lehetőséget kínál; azonban az eljárásban használt tesztkeveréket és csöveket is figyelembe kell venni.

Kövessék ugyanazt a pipetelési, keverési és inkubációs sorrendet a szabványok és az ismeretlenek esetében is. Ellenőrizzék a csövek illeszkedését a műszerhez, és tartsd be az elemzésben megadott kezelési eljárásokat. A Longlight 0,5 mL-es csőformátumot biztosít QFluo-1 számára, és szintén Qtube tesztcsövek – A rutin használat előtt ellenőrizd a cső és a reagens kombinációt a tervezett vizsgálati módszerben.

Megvan Alacsony Zárja Valódi laboratóriumi mintákkal

Egyetlen specifikációs lap sem tudja megmondani, hogy a kívánt könyvtári előkészület ismételhető eredményt ad-e Önnek. Értékeléskor használd a teszt utasításai szerint a szabványokat, majd a mintákat a laborod által használt minták széles skáláját lefedve.

Több egyet vagy többet adj hozzá, amelyek megváltoztatnák a közeli munkafolyamatban a döntést a legalacsonyabb koncentrációhoz, amelyre ezt megteszi.

Mérték ismétlései: NEM ismételt olvasás egyetlen csőből. Ez a megkülönböztetés jelzi a pipetálás vagy a reagensek előkészítése által okozott különbségeket. Figyelje meg azokat a mintákat, amelyek kívül esnek az elemzés hatótávolságán; előre határozzák meg, hogy hígítják-e, újrafuttatják-e őket, vagy jelentik-e < validáltként.

Mérték Sebesség Az egész munkafolyamat során

Egy gyors műszerolvasáshoz nem kell néhány másodperces vizsgálat. Szabványokat és mintákat kell beállítani, és a használt reagenst inkubálni kell. Tervezés áteresztőképessége az egész folyamatra, különösen egy nagy könyvtárcsoporttal egyszerre.

Longlight szerint a QFluo-1 olvasási ideje mintadarabonként legfeljebb 3 másodperc. Időzítse az eredmények előkészítését, kalibrálását, olvasását és rögzítését egy mintakísérlethez. Ez jó képet ad arról, hogy a műszer mennyire illeszkedik a laboratóriumod minőségellenőrzési tervéhez.

A Eredmény átalakítják könyvtári QC szabályvá.

A fluoreszcencia alapú kvantifikáció információt ad a DNS-koncentrációról, de nem értékeli a könyvtári fragmentum méretarányának eloszlását, és nem különbözteti meg a teljesen konstruált szekvenálási könyvtárakat más DNS-fajoktól. A könyvtár előkészítési módszerétől és szekvenálási platformjától függően további minőségellenőrzési módszerekre is szükség lehet, mint például fragmentum-elemzés vagy qPCR-alapú könyvtári kvantifikáció.

Csatolj egy dokumentumot az Approved QFluo-1 módszer rögzítéséhez.

Miután a QFluo-1 konfiguráció sikeres lett, jegyezze fel a QFluo-1 konfigurációját, a kiválasztott tesztet, a cső típusát, a szabványos előkészítést és a szabványos elfogadási kritériumokat. Add hozzá a felhasznált mintamennyiséget és az eredmények jelentését. Ez egy sikeres demonstrációt olyan eszközzé alakít, amelyet különböző operátorok ugyanúgy használhatnak.

Árajánlat vagy vizsgálat kéréséhez kérjük, adja be a Longlight-nak az analitásokat, a várható koncentrációs tartományt, napi mintaszámot, valamint a tervezett vizsgálatot. Kérjen információt a QFluo-1 elkészítéséről és a javasolt módszerrel kompatibilis fogyókról a következő vizsgálaton keresztül. Kapcsolatfelvételi oldal.

Következtetés

Az érzékeny fluorométer fontossága egy NGS laborban abban rejlik, hogy alacsony koncentrációnál is meghozhatók döntések. Értékeljék a QFluo-1-et megfelelő vizsgálattal, reprezentáló könyvtárokkal és ismételhető mintaelőkészítéssel. Minden koncentrációs eredményre ezután könnyebben alkalmazható, ha QC szabályban dokumentálják.

GYIK

K1. Az NGS könyvtár munkafolyamat során mit mér a QFluo-1?

A cél analit koncentrációjának (pl. dsDNS) megfelelő fluoreszcencia vizsgálattal mérésére használják. Válassza ki az adott anyag vizsgálatát és a minőségellenőrzést.

K2. A fent említett érzékenység elegendő egy módszer jóváhagyásához?

Nem. Értékelje a tesztreprezentáló mintákat, amelyek közel vannak a döntési határhoz, és újrakészített mintákat a rutinszerű használat előtt.

K3. Három másodperces olvasás azt jelenti, hogy az egész vizsgálat három másodpercig tart?

Nem. A minta- és szabványos előkészítés, a szükséges inkubálás és az eredmények rögzítése időigényes.

4. kérdés. Miért fontos a duplikált készítményeket tesztelni, ahelyett, hogy a tubust ismételten olvassuk?

Különálló készítmények eltérést mutatnak a pipetelésben és/vagy az elemzés előkészítési folyamatában kialakuló előkészületben. Ezek a kezelési különbségek nem figyelhetők ki egyetlen cső ismétlődő mérésével.

K5. Megszünteti-e a nagy érzékenységű fluorométer a kalibrálás szükségességét?
Nem. Kövesd az elemzés kalibrációs és minőségellenőrzési követelményeit, hogy a mérések megbízhatóak maradjanak.