G-fehérje-kapcsolt receptor: Sejtjelátviteltől a gyógyszer-felfedezésig

A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok, röviden GPCR-ek, membránfehérjék, amelyek segítik a sejteket a sejteken kívülről érkező jelekre reagálni. Ezek a jelek magukban foglalhatják a hormonokat, neurotranszmittereket, lipideket, peptideket, valamint a fényt is.

Bár a GPCR-ek hét transzmembrános szerkezetében egyértelmű közös szerkezet található, ezek nem ugyanúgy működnek. A kísérlet eredményei függhetnek a receptor ligandjától, a sejt környezetétől, a receptor expressziószintjétől és a jelátviteli partnerektől.

A kutatóknak tehát túl kell lépniük a vegyület receptor "aktiválódásának" mérésén, hogy megfejtsék a GPCR biológia megfejtését. Minden útvonal, időzítés, vizsgálati formátum, vezérlés és sejtmodell fontos.

G-fehérje kapcsolt receptor: Mi az?

Egy tipikus GPCR 7 alkalommal halad át a sejtmembránon. A sejt külső részei a jelátviteli molekulákhoz, a sejten belüli részei pedig a G fehérjékhez, arrestinekhez, kinázokhoz és más jelátviteli molekulákhoz kötődnek.

A GPCR-eket az IUPHAR/BPS Farmakológiai Útmutató több fő osztályra sorolja, például A, B, C osztály, göndör és adhézió receptorok. Az A osztály a legnagyobb, és jól ismert célpontokat érint, mint például az adrenergikus, a dopamin, az opioid és a muscarinic receptorok.

Bár szerkezetük hasonló, a GPCR-ek nagyon sokszínű jelkészletet képesek felismerni. Ez lehetővé teszi számukra, hogy érzékelésben, kardiovaszkuláris szabályozásban, anyagcserében, immunfunkciókban, hangulatban, mozgásban és még sok másban részt vegyenek.

Hogyan aktiválódnak a GPCR-ek?

Egy ligand kötődik a receptorhoz, és megváltoztatja a receptor alakját. Ennek a konformációs változásnak köszönhetően a receptor képes kölcsönhatásba lépni egy sejten belüli jelátviteli fehérjével.

Sok GPCR első partnere heterotrimerikus G fehérje, amely alfa, béta és gamma alegységekből áll. A receptorok aktiválása a GDP cseréjét eredményezi az alfa alegységben a GTP-re. Az aktivált komponensek ezután hatással vannak az alsó áramú enzimekre, ioncsatornákra és második küldöttekre.

A legnépszerűbb G-fehérje családok:

• Gs, ami általában a ciklikus AMP növekedését okozza
• A ciklikus AMP-redukáló enzim leggyakrabban használt neve a gi/o.
• A Gq/11 útvonal, amely a foszfolipáz C és a kalcium-útvonalakat jelzi
• A Rho-család fehérje és a citoszkelet válaszai G12/13 által szabályozható.

Ez a tankönyvi leírás hasznos, de a vonal ritka jelzési formája! Egy receptor több G-fehérjén keresztül is jelezhet, és az optimális jelátvitel ligandtól és sejttípustól függően változhat. A GPCRdb megemlíti, hogy a receptorok kölcsönhatásba léphetnek G-fehérjékkel, GPCR kinázokkal és lejtinekkel, amelyek különféle sejten belüli jelátviteli útvonalak kialakulásához vezetnek.

A letartóztatások szerepei

Miután a G fehérje aktiválódott, a GPCR-ek által történő jelzés nem áll meg.

A GPCR-kinázok képesek foszforilizálni az aktivált receptorokat. Az arrestinok ezután kölcsönhatásba léphetnek a receptorral, gátolhatják a receptor további kapcsolódását a G fehérjékkel, elősegíthetik a receptorok internalizációját, és részt vehetnek más jelátviteli útvonalakban.

Ezért a letartóztatás toborzása nem tekinthető "kikapcsolásnak". A receptortól és a kísérlettől függően befolyásolhatja a receptor kereskedelmét, érzéketlenítését, újrahasznosítását, lebomlását, vagy más későbbi hatásokat is befolyásolhat.

Mivel mind a G-fehérje jelátvitel, mind a leállító toborzás fontos mérőszám egy vegyület teljes farmakológia szempontjából, gyakran együtt mérik őket.

A szekcióban szereplő cikkek azt vizsgálják, hogyan vezethet ugyanaz a receptor különböző válaszokhoz

A GPCR-ek nem csak be/ki kapcsolók.

Különböző ligandok kötődnek a receptor különböző konformációs fázisaihoz. Az egyik ligandtípus magas aktivációt okozhat az egyik G-fehérje útvonalon, míg a másik több arrestin toborzást vagy eltérő jelátviteli profilt okozhat. Ezt általában funkcionális szelektivitásnak/torzított jelzésnek nevezik.

A sejtek háttere is fontos. Ugyanaz a receptor két különböző laborban is megtalálható, de eltérő mennyiségű G-fehérje, leállító, kináz, enzim vagy endogén receptor található a sejtekben.

Egy másik probléma lehet a receptorok expressziójának szintje. A túlzott expresszió fokozhatja az alacsony aktivitásra adott válaszokat és/vagy megváltoztathatja a kapcsolódási preferenciákat, és oda vezethet ahhoz, hogy egy részleges agoniszta erősebb aktivitást kapjon a sejtben, mint a natív szövetben.

Az eredményt tehát egy teljes kísérleti rendszer viselkedésének jelzéseként kell értelmezni, nem csak a receptoré.

Válassz tesztet biológiai kérdés alapján

Egyetlen GPCR teszt sem tud minden kérdésre válaszolni.

cAMP vizsgálatok

A Gs vagy Gi fehérjével rendelkező receptorokat általában cAMP-vel mérik. A Gs-válasz növelheti a cAMP-t, míg a Gi-válasz a stimulált cAMP termelésének gátlása jelezhető.

Ezeket a vizsgálatokat gyakran használják koncentráció-válasz vizsgálatokban, agonisták karakterizálási vizsgálataiban és antagonista vizsgálatokban. Az antagonista kísérletekben az agonista koncentrációját általában a tesztvegyület sejteknek való kitettsége után alkalmazzák.

Kalciumvizsgálatok

A Gq-kapcsolt receptorokat intracelluláris kalciumvizsgálatok is tanulmányozhatják. Gyors és nagy áteresztőképességű mérést adhatnak, de a válasz rövid ideig tartó lehet, és nagymértékben függ a sejtek kezelésétől, a festékek terhelésétől, a receptor expressziótól és a mérés idejétől.

GTPγS kötés

A GTPγS vizsgálatok az egyik legkorábbi esemény, amelyet a G fehérje aktiváció során mérnek, és gyakran alkalmazzák az agonista aktivitásának megerősítésére a membránkészítményekben. Mivel az elemzés meglehetősen közel van a receptor–G fehérje kölcsönhatáshoz, csökkentheti néhány erősítést a későbbi méréseknél.

Arrestin toborzás

Arrestin vizsgálatok alkalmasak az útvonal-torzítás, ligand-specifikus jel, a receptor-kereskedelem és a receptor deszentizizáció vizsgálatára. Ezeket a legjobban G-fehérje teszttel együtt használják, nem pedig egy receptor aktiválásának általános indikátoraként.

Élő sejtes bioszenzorok

A BRET és FRET technikák (valamint más bioszenzoros módszerek) képesek nyomon követni az élő sejtekben zajló jelátviteli eseményeket időfüggvényként. A legnagyobb eladási pont a kinetikus információ: a kutatók képesek mérni, mikor kezdődik a jelzés, mikor ér el és mikor csökken, mivel több végpontot is mérnek.

Készíts egy pontos GPCR kísérletet

Egy jó vizsgálat a biológiai gyógyszeren alapul, nem a műszeren.

Először is győződj meg róla, hogy a receptor kifejeződik és a sejtmembrán megfelelő helyén helyezkedik el. Az alacsony válasz nem a ligand alacsony aktivitásának következménye, hanem a rossz receptor expresszió/-kereskedelem következménye.

Másodszor, adj hozzá megfelelő vezérlőeszközöket. Általában szükség lehet egy ismert agonistákra, egy ismert antagonistara, járműkontrollokra, nem átmenő sejtekre és egy receptorfüggetlen kontrollra a lefelé irányuló vizsgálathoz.

Végül végezzen teljes koncentráció-válasz görbét. Egy vegyület egyetlen koncentrációjának értékelése nem lesz megbízható mérje a hatékonyságra, hatékonyságra, részleges agonizma, toxicitásra vagy nem specifikus interferentációra az anszával kapcsolatban.

Az időzítés szabványosítása is szükséges. Ha egyszer kalciumjelet kapsz néhány másodpercen belül, majd néhány óra múlva megméred a génexpressziót, nem lehet egyszerűen összehasonlítani a kettőt. Ugyanazt a receptort mérő tesztek különböző fázisok mérésére is használhatók.

Végül érdemes ortogonális megközelítéssel érvényesíteni a jelentős eredményeket. Ha egy vegyület aktív szerepet kap egy cAMP vizsgálatban, a legjobb, ha egy másik hasznos vizsgálattal, kötési vizsgálattal vagy receptorspecifikus pozitív kontroll segítségével megerősítjük. Az Assay Guidance Manual javasolja, hogy a GPCR találatok gondos validálása, minőségellenőrzése és farmakológiai jellemzése ajánlott az lead optimalizálás felé vezető lépés során.

GPCR-ek a gyógyszerfelfedezéshez

A GPCR-ek továbbra is kulcsszerepet játszanak a gyógyszerkutatásban, mivel számos élettani területen részt vesznek, és a sejten felszínen fejeződnek ki. A GPCRdb becslése szerint az emberi hormonok 25%-a vesz részt a receptorcsalád tagjaira adott válaszban, és a gyógyszerek körülbelül egyharmada a receptorcsalád tagjait célozza meg.

A hagyományos programok fő keresőcélpontjai vagy agonisták, vagy antagonisták voltak, amelyek a fő ligand-kötő helyhez kötődnek. Jelenleg is vizsgálják az alloszterikus modulátorokat, az útvonal-torzítású ligandokat, a receptor–transzduktor szelektivitását, a kötő kinetikát és a szerkezetalapú vegyületek tervezését.

A strukturális biológia megjelenésével ez egyre megvalósíthatóbbé vált. A GPCRdb ma már olyan eszközöket tartalmaz, amelyek összehasonlítják a GPCR-ek kötő helyeit és aktivációs állapotait, beleértve a kísérletileg meghatározott receptorszerkezeteket, receptor–ligand komplexeket és receptor–G fehérje komplexeket.

Egy jó szerkezetű vegyületet funkcionális tesztnek kell alávetni, még akkor is, ha jó szerkezetűek vannak. Egy molekula kötődhet egy erős kötőhatású célponthoz, és nem indíthatja el a kívánt sejtválaszt, vagy alternatívaként egy molekula bekapcsolhatja a kívánt útvonalat, de nem megfelelő módon.

Következtetés

A G-fehérje-kapcsolt receptorokat leginkább nem csupán membránkapcsolóként, hanem rugalmas jelátviteli rendszerként is érdemes felfogni.

A receptor alakját változtatja a ligand-kötés hatására, a receptor megtalálja partnereit a sejtben, és a sejt környezete határozza meg a jel menetét. Ezért fontos figyelembe venni az eredmények kiválasztását, a receptorok expresszióját, az útvonal időzítését, a kontrollokat és az ortogonális validációt.

A GPCR kutatás és gyógyszer-felfedezés legjobb következtetései gyakran a szerkezeti információk és több funkcionális vizsgálat kombinációja révén születnek.

GYIK

1. kérdés. Mi a GPCR fő funkciója?

A GPCR egy sejtfelszíni receptor, amely egy extracelluláris jelre reagál, és sejten belüli választ generál. A válasz lehet G-fehérjék, leállítók, második futárok, ioncsatornák vagy génszabályozás.

K2. Minden GPCR-t ugyanaz a G fehérje aktivál?

Nem. Különböző receptorok előnyben részesíthetik a különböző G fehérjék aktiválását (Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13 vagy több jelelő partner(ek)).

K3. Mi az az árva GPCR?

Az árva GPCR olyan receptor, amelynek természetes aktiváló ligandja nem biztos. Ezek a receptorok továbbra is jelentős jelentőséggel bírnak az alapkutatás és a gyógyszerfejlesztés szempontjából.

4. kérdés. Szóval, melyik tesztet érdemes használni GPCR szűréshez?

A "legjobb" vizsgálat attól függ, hogy milyen kérdést választanak a megválaszolandó kérdéstől és a receptor jelátviteli útvonalától. A válasz különböző aspektusait cAMP, kalcium, GTPγS, arrestin és élő sejtes bioszenzor tesztek mérik.

K5. Miért alkalmaznak több vizsgálatot a kutatóknak?

Egy teszt csak egy útvonalat mérhet, vagy formátumspecifikus interferenciákat mutathat. Ha ortogonális vizsgálattal bizonyítható, hogy a megfigyelt hatás valóban receptorhoz kapcsolódik, akkor levonható, hogy ez valóban a receptor hatása.