UV transzilluminátor: A megfelelő rendszer kiválasztása és használata a gélvizualizációhoz

az eredmény problémás az UV-transzilluminátor. Egyszerű módon olvassa fel a DNS-, RNS- vagy fehérjesávokat, ultraibolya fényt áthaladva egy színezett gélen. Az operátor ezután megvizsgálhatja a gélt, lefényképezhet, vagy kivághatja a kívánt szalagot, hogy később vele dolgozhasson.

A legtöbb probléma nem a tápkapcsolóval kapcsolatos. Ezeket a hibás hullámhossz, összeegyeztethetetlen világítás és folt, túl hosszú expozíció és az UV-védelem hiánya okozza.

Egy jó UV transzilluminátor munkafolyamatnak tiszta sávokat kell biztosítania, csak a mintavételi és a hangszert használó személy minimális expozíciójával.

Hogyan működik egy UV transzilluminátor

A gélt ezután elektroforizálják, így molekuláris fragmentumok maradnak hátra, amelyek általában szabad szemmel nem láthatók. Egy fluoreszkáló folt, amely a festékre tapad vagy érintkezik a festékkel. A festett gél ezután átkerül a megvilágított felületre, ahol a festéket az ultraibolya fény gerjeszti, és olyan fluoreszcenciát bocsát ki, amely a szem számára látható.

A sötét háttér és a világos sávok lehetővé teszik, hogy közelítsd meg a fragmentumok méretét, összehasonlítsuk a minták intenzitását, ellenőrizd az erősítő termékeket, vagy találj anyagot a gél kivonáshoz.

Számos UV transzilluminátor elérhető szabványos hullámhosszakon: 254, 302 és 365 nm. Néhány egyhullámhosszt kínál, mások kettőt vagy hármat; Melyik a legjobb, attól függ, milyen típusú hangszer és milyen hullámhossz lenne. A gélszemlélő és elektroforézis alkalmazások széles UV-tartományt használnak 302 nm közelében.

Válaszd ki a tényleges alkalmazáshoz a hullámhosszt

A fluoreszcencia intenzitását, a minta károsodását és a festékkompatibilitást a hullámhossz kiválasztása befolyásolja.

Gyakran alkalmaznak 302 nm-es forrást fluoreszkálóan festett DNS és RNS gélek vizsgálatakor, mivel általában nagy intenzitású jelet ad, és számos ismert nukleinsav-festék használható ezzel a forrással. Egyszerű megoldás a rutinos gélellenőrzésekre és dokumentációra.

Ha az UV-fertőzés csökkentése fontosabb, mint a lehető legerősebb jel, akkor hosszú hullámú UV-t használhatunk, amely közel 365 nm-t jelent. Thermo Fisher azt javasolja, hogy minimalizáljuk a DNS-expozíciót, és hosszabb hullámhossz (kb. 360 nm) használatát javasolja, ha a gélből DNS megnyerhető.

A rövidhullámú UV (közel 254 nm) használata a DNS-gélek rutinszerű megtekintéséhez nem tekinthető automatikusnak, bár néhány laboratóriumi transzilluminátor is elérhető. Használható a fluoreszkáló anyagtól és a laboratóriumi alkalmazástól függően.

A legnagyobb hullámhossz tehát nem a leghatékonyabb megoldás. Ez az, ami illeszkedik a folthoz, és eléggé megőrzi a mintát a következő lépéshez.

Használj más színű gélfoltot egy másik színű fényforráshoz

Egy átalakító és gél fényezést egy optikai rendszerként kell kezelni.

Különböző típusú festékek léteznek, amelyek eltérő izgatási és kibocsátási jellemzőivel rendelkeznek. Egy folt magas UV-visszaverődéssel és alacsony a kék fény visszaverődésével, és fordítva. A kamera szűrőjének engednie kell, hogy a kibocsátott fluoreszcencia átjusson rajta, és megakadályozza a nem kívánt gerjesztő sugárzás átjutását.

Új vizsgálat előtt:

• A foltot kiváltó hullámhosszok a lequel. A foltot izgató hullámhosszok a "luequelek".
• A fényképészeti szűrő használatáról az egyéni fotós dönti el.
• A festő anyag (DNS, RNS vagy fehérje) jellemzői
• Ha a gélt vágni kell, hogyan dokumentálják?
• Ha a fényforrás új technológia, van-e módszer annak rögzítésére a jelenlegi képalkotó rendszerrel?

Például a SYBR Safe festett géleket megfelelő fluoreszcencia berendezéssel, UV vagy kék fényszűrővel lehet képezni – az etidium-bromid képalkotó szűrő nem feltétlenül alkalmas.

Ha egy kép túl halvány, az nem feltétlenül jelenti azt, hogy túl kevés DNS van a gélben. Az ok lehet a megfelelő gerjesztő hullámhossz, rossz kameraszűrő, elavult UV-lámpák használata vagy túl sok szobafény.

Ha a DNS károsodása helyreáll, korlátozzuk az UV-sugarak elleni kitettséget

A nukleinsavak érzékenyek az UV-fény által okozott károsodásra. Ez akkor jelentős, ha a kutató DNS-szalagot szeretne kinyerni a gélből, és a maradék DNS-t későbbi alkalmazásokban, például klónozásban, ligációban, szekvenálásban vagy más alkalmazásokban felhasználni.

A hosszú expozíció a DNS bevágásához és egyéb károkhoz vezethet, ami befolyásolhatja a visszanyert DNS minőségét. A hosszú ideig tartó UV-kitett hatás DNS-károsodást okozhat, ami hatással lehet a későbbi alkalmazásokra, például a szubklónozásra – emeli ki Thermo Fisher.

Ha UV vizualizációra van szükség:

1. Állítsd be a vágószerszámokat és a gyűjtőcsövet, mielőtt felkapcsolnád a lámpát.
   1. Állítsd be a legalacsonyabb beállítást, ami tiszta sávot eredményez.
   1. Az expozíciót minimálisra kell tartani.
   1. Ha lehetséges, gondolj egy hosszabb hullámhosszra az UV fényhez.
   1. Ne nézze meg újra ugyanazt a gélt.
   1. Jegyezd fel a kiválasztott sávot, és kapcsold ki a forrást.

Egy kék fény transzilluminátor, amely kompatibilis a klónozáshoz, különösen érzékeny klónozási munkához is alkalmasabb lehet. A színeket kék fény is gerjesztheti, és kevesebb kárt okozott a DNS-ben a kék fény.

Ellenőrizd a megvilágítás egyenletességét

A transzilluminátornak egyenletes megvilágítást kell biztosítania a nézendő területen.

Ha az egyik oldal intenzívebb, mint a másik, azonos sávok változnak az intenzitásuk attól függően, hogy a gélen elhelyezkednek. Ez különösen fontos, ha a sávokat ugyanabban a laboratóriumban hasonlítják össze, és/vagy amikor félkvantitatív elemzéshez képet alkalmaznak.

Az egységességet befolyásolja a lámpák állapota, a lámpák, szűrők elrendezése, a felületek tisztasága és az eszköz optikai kialakítása. Az egységes megvilágítás fontos az UVP kontextusában, hogy az eredmények ismételhetősége különböző sávokban és sávokban érhető el.

Mindig vizsgáld meg a hátteret, hogy kiegyenlítsd a gél egészét, mielőtt a szalag intenzitásától függsz. Ugyanaz a gél áthelyezése a felület másik részére segíthet a világítási probléma kialakulásában.

Használd a megfelelő nézőterületet

A felület megvilágítására alkalmas területnek kell elegendőnek lennie a gél eltakarására, de nem foglal el plusz helyet a padon.

Egy kis cella remek a standard mini-gélekhez. Nagyobb platformok jobb nagy formátumú gélekhez, vagy több gél egymás mellett történő megoldáshoz. Kereskedelmi rendszerek is elérhetők, amelyek különböző megvilágított területekkel rendelkeznek, általában kb. 20 x 20 cm vagy annál nagyobbak.

Minden gélnek laposnak kell lennie a felületen. A szalagok visszaverődése és elmosódása a védőfólia ráncai, túl sok puffer vagy egyenetlen tálca miatt lehetséges.

Ügyelj rá, hogy a nézőfelület tiszta; Csak olyan anyagokat és tisztítószereket használj, amelyek kompatibilisek az UV szűrővel. A képeket karcolások, foltok vagy megszáradt pufferlerakódások befolyásolhatják.

Ügyelj arra, hogy megvédd a felhasználót az UV-kisugárzástól

Az UV átalakító NEM szabványos látólámpa, hanem egy nagy intenzitású fényforrás, amelyet laboratóriumi használatra terveztek.

Akár közvetlen vagy közvetett UV-sugárzás okozhat szem- és bőrkárosodást. A Stanford laboratóriumi biztonsági irányelvei a transzilluminátor használatára vonatkozó következő óvintézkedéseket sorolják fel: tartsa a hozzáférést a transzilluminátor használat közben, tartsa távol a fényvisszaverő felületeket a transzilluminátortól, és tűz ki táblákat, amelyek jelzik, hogy a bőr és a szem védve kell.

Mindig használd a műszerhez mellékelt védőfedőt, védőpajzsot vagy zárt képalkotó szekrényt. A géllel való munkavégzéshez szükséges laboratóriumi gyakorlatok az arc takarását, kesztyűt, rögzített laboratóriumi kabátot és UV-blokkolóval való lefedést igényelhetnek.

Ne feltételezd, hogy a normál védőszemüveg blokkolja az UV hullámhosszát. Viseljen megfelelő védőfelszerelést, amelyet az eszközhöz rendeltek, és tartsa be a laboratórium sugárzásbiztonsági szabályait.

A jobb expozíció szabályozást egy zárt gél-dokumentációs rendszer biztosítja, amely biztonsági záróval rendelkezik, szemben a nyitott fénydoboz fölött való munkavégzéssel. Néhány rendszer nem engedi meg a képalkotó ajtó kinyitását UV mód közben.

Az oktatóknak következetes nézési munkafolyamatot kell kialakítaniuk

Van egy egyszerű pálya, amellyel minimalizálható a felesleges változatosság:

• Elektroforézis és festés 1. Elektroforézis és 1 festés.
• Győződj meg róla, hogy a folt megfelelő hullámhosszú legyen.
• Győződj meg róla, hogy a géltálca külső tiszta és száraz legyen.
• Válassza ki a szükséges UV hullámhosszát és intenzitását.
• Terítsd meg a gélt a középső látóterületre.
• Zárd be a védőpajzs/képalkotó zárót.
• Használd a lehető legrövidebb expozíciós időt a látható sávok létrehozásához.
• Készítsd el a képet a megfelelő emissziószűrővel.
• Kapcsold ki az UV-fényt, amikor a gélt mozgatod.
• Töröld le a felületet használat után.

Ha több kísérletet végeznek, a foltkoncentrációnak ugyanolyan kell legyen, akárcsak a képalkotó szűrő, expozíciói idő, intenzitási beállítás és a kamera állapota.

Csatlakoztasd a transzilluminátort a képalkotó munkafolyamatba

Ha a felhasználónak nem kell gélt ellenőriznie, akkor asztali transzilluminátort használhat. Igényesebb alkalmazásokhoz teljes géldokumentációs rendszerre van szükség, beleértve a fényképezőgépet, sötét házat, szűrőket és képelemző szoftvert.

Az integrált rendszerek képrögzítésre, sávmérésre, dokumentációra és rendszeres gélelemzésre is használhatók. A Bio-Rad jellemzi a gél-dokumentációs platformokat, amelyek irányított világítást és automatikus képfelvételi és elemző szoftvert kínálnak.

A döntés attól függ, mit fog tenni a labor a képzel. Egy kutatólaboratóriumban a tanító laboratóriumnak egyértelmű vizuális megerősítésre lehet szüksége, a kutatólabornak pedig nyomon követhető képfájlokra, következetes expozícióra és kvantitatív sávelemzésre.

Soha ne távolítsd el a fényforrást

Még ha az UV-lámpák úgy is néznek ki, mintha bekapcsolnának, idővel elkezdik csökkenteni a teljesítményüket. Csökkentett intenzitással az operátor megnöveli az expozíció idejét, ami csökkentheti a konzitusztenciát és a több mintaexpozíciót.

Kövesd a gyártó lámpakarbantartási irányelveit. Az UV radiométer objektívebb mérőszám lenne, mint a vizuális becslés, és az UVP megállapította, hogy az irradianciamérés megfelelő módszer az UV forrás hasznos élettartamának monitorozására.

Cseréld a lámpákat, ha ajánlják, alaposan tisztítsd meg a nézőszűrőt, és jegyezd fel a karbantartási dátumokat. A fluoreszkáló UV-lámpák higanyt is tartalmazhatnak, ezért a helyi előírásoknak megfelelően veszélyes hulladékként kezelni és ártalmatlanítani kell.

Következtetés

UV-transzilluminátort használva zselés vizualizációhoz gyorsan és tisztán megteheti, de nem csak ultraibolya fényben is világos a jó eredmény eléréséhez.

A hullámhossznak megfelelő kell lennie a festéshez és az alsóbb felhasználáshoz. A megvilágításnak a lehető legegyenletesebbnek kell lennie, az expozíciónak a lehető legrövidebbnek kell lennie, a kamera szűrőjének ugyanolyan kell legyen, mint a kibocsátott fluoreszcencia, és a felhasználót védeni kell a fényforrás UV-kioltásától szemben.

A megfelelő műszer az, amely alkalmazkodik a gél méretéhez, a festési módszerhez, a képalkotó követelményekhez, a minták visszanyeréséhez szükséges munkafolyamathoz és a laboratóriumi környezethez szükséges biztonsági ellenőrzésekhez.

GYIK

1. kérdés. MIRE használják UV transzilluminátort?

Elsősorban arra használják, hogy színezett fluoreszkálóan jelölt DNS, RNS vagy fehérje sávjait vizualizálják elektroforézis gélekben. Ez beépíthető egy gél-dokumentációs rendszerbe is.

K2. Az alábbi hullámhosszok közül melyiket használják leggyakrabban DNS-zseleknél?

A középtartományú UV (közel 302 nm) gyakori használata a gélek rutinszerű megtekintése. A végső választásnak hasonló kell lennie a folthoz, valamint a lefelé történő felvitéshez.

K3. Mutálódik-e az UV-fény a DNS-t?

Igen. A hosszú expozíció DNS-károsodást okozhat, és csökkentheti a DNS klónozhatóságát, valamint az utóbbi alkalmazásokat.

4. kérdés. Melyik hatékonyabb: kék fény vagy UV fény?

Ha UV-károsodás vagy DNS-károsodás aggodalomra ad okot, kék fény használata ajánlott kompatibilis foltokhoz. Még néhány ismert foltnál is az UV jobb gerjesztést adhat.

K5. Miért van gyengeség a Gel Bands-ban?

Ez valószínűleg alacsony mintakoncentráció, nem megfelelő folt, nem megfelelő hullámhossz vagy szűrő, öregedő lámpák, túl sok háttérfény vagy rossz foltozás miatt van.