Molekuláris biológiai képalkotó rendszer: a megfelelő platform kiválasztása a gélekhez és foltokhoz

A molekuláris biológiai képalkotó rendszer digitalizált kimenetet biztosít egy gél vagy membrán számára, amely megtekinthető, számszerűsíthető, tárolható és összehasonlítható. Beállítható úgy, hogy DNS-t és RNS-t tartalmazó géleket, színezett fehérjegseleket, kemilumineszcens western foltokat, fluoreszkáló foltokat és kolorimetrikus mintákat szkennelje.

Egy rendszert kell használni az teszthez, nem fordítva.

Hogyan működik a molekuláris biológiai képalkotó rendszer?

Egy szabványos képalkotó rendszer tartalmazna fényzáró kamrát, kamerát, lencsét, mintaszínpadot, a kívánt gerjesztéshez használható fényforrásokat, szűrőket, amelyek lehetővé teszik, hogy csak egy bizonyos frekvenciájú fényt engedjenek át, a kamera számára a kép rögzítésére szolgáló szoftvert, valamint a kép elemzésére szolgáló szoftvert.

Nukleinsav-gélek esetében a műszer UV, kék vagy más megfelelő fényt sugároz egy fluoreszkáló folton. A fehér fényt gyakran használják fehérjegélekhez, amelyek láthatóak. A kemilumineszcens Western foltokban keletkező fény saját készítésű, kémiai reakcióból származik, ezért érzékeny kamerára és sötét képalkotó kamrára van szükség, de nem magas intenzitású fény a mintán.

Néhány mindent egyben platform képes a géldokumentáció, kolorimetrikus képalkotás, kemilumineszcencia és fluoreszcencia egy házban. Például a bio-Rad olyan rendszereket biztosít, amelyek nukleinsav- és fehérjegéleket, valamint kemilumineszcens foltokat képeznek, és a rendszerek bővíthetők látható csatornával, távoli vörös és közel infravörös fluoreszkáló csatornákkal.

Kezdheted a mintákat, amiket futtatsz,

Az első hely, ahol a labor dolgozni kell – nem a specifikációs lapon!

Egy oktatólaboratóriumnál, amely elsősorban az agarózelekre fókuszál, az UV, a kék és fehér fény képalkotási típusai lehetnek az egyetlenek. Egy pontos fehérjekutató laborhoz finom kemilumineszcencia és számos fluoreszcens csatorna szükséges.

A Thermo Fisher vizualizációs rendszereit olyan rendszerekre osztja, amelyek egyszerűen vizualizációt nyújtanak, illetve szoftveres elemzést, valamint kemilumineszcens Western foltot és többcsatornás fluoreszkáló képalkotást kínálnak. Egy hasznos emlékeztető: a géldokumentációs rendszer nem feltétlenül olyan eszköz, mint a többmódú molekuláris képalkotó.

Egyeztesd az excitációs forrást és a szűrőt a festékhez

Minden fluoreszkáló festéknek optimális hullámhossztartománya van a megvilágításához és a fény kibocsátásához. A képalkotó rendszert megfelelő fényforrással kell felszerelni a festék gerjesztéséhez, valamint egy emissziós szűrővel, amely lehetővé teszi, hogy a fluoreszcencia (fluoreszcencia) fotonok eljussanak a kamerához, miközben kiürítik a festék gerjesztéséhez használt fényt.

Az alábbiakban olyan rendszerek példái találhatók, amelyek tartalmazhatnak:

• UV átfényezés
• Kék fény átvilágítás
• Fehér átszűrődő fény
• A fehér visszavert fény
• Látható fluoreszkáló gerjesztés
• Közeli infravörös fluoreszkáló gerjesztés

Nincs összefüggés a fényforrás száma és minősége között. A kulcs, hogy a telepített hullámhosszak és szűrők kompatibilisek-e a laborban már használt festékekkel, antitestekkel és fluoreszkáló címkékkel.

A laboratórium reagenslistáját ellenőrizd a rendszer vásárlása előtt, hogy megbizonyosodj róla, hogy az alkalmazások támogatják-e. Kérjük, vegye figyelembe, hogy nem minden fluoreszkáló festék rögzíthető, mert a rendszert "fluoreszcens képalkotónak" nevezik.

A kemilumineszcencia és a fluoreszcencia nagyon hasonlóak

A kemilumineszcens western foltozásban a fény egy kemiluminescens reakcióval keletkezik, amely általában egy antitest-enzimen és lumineszcens szubsztrátron alapul. A jel idővel változik – a képalkotást a reagens számára javasolt munkaidőn belül kell elkezdeni.

A nyugati foltozáshoz a fluoreszkáló fény külső fényét igényli. Használható kísérletek multiplexjére, így több célpontot is észlelhetünk ugyanazon a membránon különböző fluoreszkáló csatornákon keresztül.

A kemilumineszcenciát általában használják az érzékeny és rutinszerű kimutatáshoz. Amikor a multiplexálás vagy a stabil jelrögzítés vagy kvantitatív összehasonlítás kulcsfontosságú, gyakran a fluoreszcenciát választják. Nincs egyetlen legjobb módszer, mivel ez az elemzés követelményeitől, a célpont mennyiségétől, az antitestektől, a használt címkéktől és az elemzési céloktól függ.

Ha egy laboratórium rendszeresen mindkét tesztet végzi, biztosítania kell, hogy a javasolt rendszer lehetővé tegye a tesztek lefuttatását úgy, ahogy vannak, és komplex hardverváltozások nélkül.

Fényképezéskor vegyük figyelembe a dinamikai tartományt és a telítettséget

Néhány blot egy nagyon erős zenekarral és több gyenge zenekarral is rendelkezhet. Az erős sáv telített lehet, ha az expozíció elég hosszú lenne ahhoz, hogy a gyenge jeleket megmutatja.

Amikor annyi fény van, hogy a kamera pixelei már nem tudnak megfogni. Ezután megőrzi a megjelenített sáv látszólagos tisztasága, de az intenzitás szintje nem használható mennyiségi összehasonlításra.

A dinamikatartomány az a gyenge és erős jelek tartománya, amelyeket egy képalkotó rendszer képes egyetlen képen rögzíteni. A nagyobb dinamikatartomány lehetővé teszi a halvány és intenzív sávok könnyebb rögzítését anélkül, hogy elveszítenénk az információt.

Néhány képalkotó platform képes telített pixeleket érzékelni, megfelelő expozíciót javasolni vagy többszörös expozíciót alkalmazni. Csökkenthetik a próbálkozás-hiba képalkotások számát, de nem helyettesíthetik a jó kísérleti terveket. Még ha a minták túlterheltek is, akkor is korrektálni kell őket az anszia fázisában, és az antitest-jeleket is, amelyek túl erősek, korrigálni.

Az automatikus expozíció használatát kerülni kell

Az automatikus expozíció hasznos lehet, ha több személy vált fel a hangszeren, vagy ha vannak olyan tényezők, amelyek miatt a jel erősségének mérése nehez.

Egyes rendszerek rövid kezdeti expozíciókat kapnak, majd ezek alapján általános expozíciót javasolnak. A fényforrást, fókuszt és alkalmazásbeállításokat mások automatikusan választják ki.

Ez lehetővé teheti, hogy a rutinszerű képalkotás gyorsabb legyen, de kérjük, ellenőrizze az operátor. Nézd meg, hogy:

• Megjegyzés: A telítettség fontos sávok esetén ajánlott.
• Gyenge sávok láthatók a háttér tetején
• Az egész látómezőt lefedi a teljes minta.
• A legjobb eredmény érdekében a megfelelő képalkotó módot használtuk.
• A szükséges szűrőt és tálcát használták
• Az alábbiakban kvantitatív elemzések szükségesek az expozíciós pereket:

Az automatikus beállítások jó kiindulópont, de NEM kifogás arra, hogy ne vizsgáljuk meg a képet.

Győződj meg róla, hogy a felbontás, az érzékenység és a látómező mind helyes legyen

A felbontás fontos a kamera által rögzített kép szempontjából, de a megapixelek száma nem jelzi a kamera képminőségét.

Az is fontos, hogy egy hasznos rendszer legyen, amely elég érzékeny, alacsony háttérrel, jó optikával, egyenletes, és elég nagy látóterével rendelkezik ahhoz, hogy elférjen a laboratóriumban használt gélek vagy membránok számára.

Ha a kemilumineszcens jelek gyengék, nagyon érzékeny kamerára lesz szükség. Minél nagyobb a távolság a sávok között, annál kevesebb felbontásra van szükség; minél kisebb a sávok közötti távolság, annál fontosabb a felbontás, és minél kisebb a mintában elválasztandó jellemző, annál nagyobb felbontásra van szükség.

A legnagyobb laboratóriumi géltálcát, foltot vagy több gél tálcát helyezze a képalkotás helyszínére vásárlás előtt. Ha egy nagy gélt több képre bontogatnak, az elveszett erőfeszítés lesz, és az összehasonlítás nehezebbé válik.

Biztosítsuk, hogy a képek következetesen készüljenek

Ajánlott ugyanilyen körülmények között készíteni képeket a képek összehasonlításakor.

Írd fel a képalkotó módot, a fényforrás típusát, a szűrőt, az expozíció idejét, a binnelést, fókuszt, mintapozíciót, elemzési beállításokat, hátteret és bármilyen háttérkorrekciót. Ha szükséges, használd újra a mentett protokollokat.

Ha színezés vagy tisztítás történik, győződj meg róla, hogy a nukleinsav és fehérje gélek feltételei megegyeznek. Szabályozza a kontrollminták terhelését, az antitestek koncentrációját, az alszubsztrát idejét és a membrán kezelését Western foltokban.

A képalkotó csak azt a mintát tudja rögzíteni, amelybe bekerül. Nem tudja kijavítani az egyenetlen átvitelt, a túl sok háttért, a túlterhelt sávokat vagy az antitest-specifikusság hiányát.

Tesztelje az elemző szoftvert

A képelemző szoftverekkel nem lehet nehéz feladatokat elvégezni, és a szoftver nem takarta el az eredmény előállítását.

Néhány ügyes funkció lehet:

• Sáv- és sávérzékelés
• Molekulatömeg-becslés
• Háttérkivonás
• Sáv-intenzitásmérés
• Telítettségi figyelmeztetések
• Normalizáció
• Multiplex csatorna kijelző
• Kép annotáció
• Adatexport
• Amikor a felhasználót vagy a kísérletet rögzítik.

A beépített elemzés előny a rutinmunkához, és az asztali szoftverek alkalmasabbak lehetnek részletes elemzésre, valamint a végső számok előkészítésére. Például a termo fisher képalkotó rendszerek fedélzeten történő felvételt és elemzést, valamint külső szoftveres munkafolyamatokat kínálnak.

Az eredeti képfájlt mindig is tartsd meg, ameddig csak tudod. A megjelenített kép beállítása nem helyettesítheti a nyers felvételi adatokat.

Ügyeljen arra, hogy óvintézkedéseket tegyen és további lépéseket tegyen a minták biztonsága érdekében

Fontos a megfelelő árnyékolás biztosítása, mivel az UV képalkotó eszköz közvetlen vagy visszavert ultraibolya fénye károsíthatja a szemet és a bőrt. Az expozíció csökkenthető a képalkotó kamra bezárásával, ami kevesebb, mint a nyitott UV fénydoboz.

Ha a DNS-t a gélből akarják kinyerni, a kék fény gerjesztése jobb lehet a megfelelő nukleinsav-színek esetén. A fehérfényes képalkotás megszünteti az UV használatát a látható fehérjefoltok megtekintésére.

A rendszert úgy is ki kell tervezni, hogy a minták közötti szennyeződés elkerülje a mintáról mintára. Mosd el a mintatálcákat, távolítsd el a pufferkiömlést mielőbb, és kövesd a gyártó irányelveit a szűrők, lencsék és képalkotó felületek tisztítására.

Biztosítsuk, hogy a rendszer optikai műszerként legyen beállítva.

A molekuláris biológiai képalkotót nem lehet néha tisztítani.

A fényforrások idővel elkopnak, a szűrők megkarcolhatnak, a mintatálcák foltosodhatnak, és a por befolyásolhatja a képminőséget. A laboratóriumoknak nyomon kell követniük a világítást, ellenőrizniük a tálcákat és szűrőket, biztonsági mentéseket kell készíteniük a beszerzési protokollokról, gondosan frissíteniük a szoftvert, és fenntartaniuk kell a karbantartás dokumentációját.

Ha a képminőség nem jó, nézd végig az egész folyamatot, hogy van-e probléma a kamerával vagy a lánc többi részével. Ezt okozhatja a folt, a minta vagy az aljzat, az expozíció beállítások, a fényforrás vagy a szűrő.

Következtetés

A leghasznosabb platform nem mindig az, amelyik a legtöbb funkcióval rendelkezik. Ez az, amely a megfelelő világítást, érzékenységet, dinamikatartományt, szoftvert, képalkotó területet és munkafolyamatot kínál, amelyeket más felhasználók képesek reprodukálni.

A jó képalkotás már a mintakészítés szakaszától kezd. Az eszköz rögzíti a kísérletet, de ha az elemzés előkészítése gondosan elkészül és az felvételt ismételten végzik, akkor a kép (rekord) jelentőségteljes.

GYIK

1. kérdés. Mit tud rögzíteni egy molekuláris biológiai képalkotó rendszer?

Képes DNS- és RNS-géleket, fehérjegseleket, kemilumineszcens western foltokat, fluoreszkáló western foltokat és kolorimetrikus membránokat rögzíteni a beállításoktól függően.

K2. Mi a különbség a Gel Dokumentációs System és a Western Blot Imager között?

Nem mindig. Az alap gélrendszer csak UV, kék-fehér fény képalkotást támogathat, míg a Western folt-képalkotók érzékeny kemilumineszcenciát vagy többcsatornás fluoreszcencia detektálást igényelhetnek.

K3. Miért fontos a dinamikai tartomány? Miért fontos a dinamikai tartomány?

A jelek nagy dinamikai tartománya lehetővé teszi a gyengék és erős jelek rögzítését anélkül, hogy a legerősebbek telítették volna. Ez különösen igaz a kvantitatív analízisre.

4. kérdés. Megbízható az automatikus expozícióban?

Hasznos lehet meghatározni a kezdő expozíciós tartományt. Az operátornak más tényezőket is meg kell figyelnie, mint például telítettség, háttér, gyenge jelek és képalkotó mód.

K5. Mi a legjobb képalkotó mód?

A használt mód a minta, a festés, a címkézés és az elemzés célpontjától függ. A fényforrás, a szűrő és a kamera beállításai az teszttől függenek.