Kromatin nyírás: Hogyan építsünk reprodukálható ChIP munkafolyamatot

A kromatin levágása az egyik legérzékenyebb lépés a ChIP protokollban. A túl nagy töredékek a felbontás csökkenéséhez és rossz immunoprecipitációhoz vezethetnek. A túl nagy intenzitású nyírás epitóp, DNS-fehérje komplex és visszanyerhető anyagi károsodáshoz vezethet.

Egyetlen program nem fog minden mintára működni. A kromatin ultrahangenergia válasza különböző sejttípus, rögzítés, indító anyag függvényében, valamint a kromatin lízis hatékonyságától és a minta térfogatától függően. Az egész előkészítési folyamatot ellenőrizni kell, hogy megbízható eredményeket érjenek el, ne csak a szonikálási idő változtatása legyen.

Mi az Nyírás Kromatin?

Az immunoprecipitáció előtt a kromatin nyírása a keresztkötő kromatint kisebb DNS-- fehérje töredékekre bontja. Ezután antitestek gazdagíthatók a kromatin gazdagítására, amely egy adott transzkripciós faktorhoz, hiszton vagy hiszton módosításhoz kapcsolódik.

Az immunoprecipitáció után a keresztkapcsolatokat visszafordítják, a DNS-t tisztítják, és a gazdagított területeket qPCR-rel vagy szekvenálással elemzik. Longlight-ok ChIP-seq megoldások segítséget nyújtanak a fehérje–DNS kölcsönhatások és a genom-szintű szabályozó helyek tanulmányozásához.

A kromatin nyírás eltér a tisztított DNS fragmentációtól, mivel a nukleoszómák, a kapcsolódó fehérjék és a formaldehid keresztkötések megváltoztatják a DNS hozzáférhetőségét és mechanikai tulajdonságait.

Miért van Fragment Méret fontos?

A nagy fragmentumok csökkentik a pozíciós felbontást, mert a visszanyert DNS sokkal hosszabb lehet, mint a fehérje kötődő helye. Háttért is emelhetnek, ha körülöttük olyan területek vannak, amelyek nem specifikusak, de mégis fizikailag összekapcsolódnak.

Ne feltételezze, hogy a nagyon rövid darabok feltétlenül jobbak. A túlzott feldolgozás az immunoprecipitációs termés csökkenéséhez, érzékeny epitópok elvesztéséhez vagy a könyvtári profil hiányához vezethet.

Az optimális fragmentumméret a ChIP protokoll, a biológiai célpont, az alkalmazott antitestek és az alkodik elemzése alapján változik. Ezért a laboratóriumoknak elfogadható eloszlást kell meghatározniuk saját vizsgálatukhoz, nem csak egy univerzális átlagméretet.

Mi a helyzet Nyírás keresztkötéssel?

A keresztkötés fenntartja a fehérje-DNS kölcsönhatást, míg a túl intenzív keresztkötés megnehezítheti a kromatin fragmentálását, és elhomályosíthatja az antitest epitópokat. Gyenge vagy átmeneti kölcsönhatások elveszhetnek a elégtelen fikáció miatt.

A rögzítési idő a minta típusától, a reagensek koncentrációjától, sejtsűrűségtől és a célfehérjétől függően változik. A hűtés egyenletesnek is kell lennie, mivel a minták viselkedése további keresztkötés esetén változik.

Ha a minta továbbra is ellenáll a nyírásnak annak ellenére, hogy növeli az akusztikus energia mennyiségét, az nem oldja meg az alapvető problémát. A keresztkötési és hűtési feltételeket figyelembe kell venni az agresszívebb program bevezetése előtt.

Miért a sejtbemenet és Fontosak a lízisek?

A sejtek mennyiségének túlzott mennyisége vastag, ragadós kromatint eredményezhet, amely szabálytalanul nyír. A túl kevés kiindulóanyag növelheti a kezelési veszteségeket, és megnehezítheti a kromatin minőségének értékelését.

A kísérletek közötti sejtszámot egyenlővé kell tenni. A szövetminták extra gondosságot igényelnek, mivel nagy a heterogén lizátum kialakulásának kockázata az extracelluláris anyag, szerkezeti különbségek és a hiányos disszociáció miatt.

A szonikálás előtt kulcsfontosságú a magok és a kromatin hatékony felszabadulása. A hiányos lízis megszakítás nélküli magok vagy sejtcsoportok jelenlétéhez vezethet, amelyek más módon vannak kitéve az energiának, mint a mintavétel többi része.

Hogyan fókuszált Ultrahang Segít javítani az irányítást?

A szonákszonikátorokat olyan helyeken használják, ahol az energia közvetlenül a mintához jut. A szennyezési potenciál a szonda pozíciójától, mélységétől és az operátor technikájától is függhet.

A fókuszált ultrahangozást használják az akusztikus energia irányítására egy kapcsolódási közegen keresztül egy zárt mintaedénybe. Ez egy kontrolláltabb, érintésmentes feldolgozási környezetet eredményez.

A BoFU-100 fókuszált ultrahangos készülék hőmérséklet-szabályozott DNS, RNS és kromatin nyírást biztosít. A BoFU-1600 rendszer lehetőséget kínál többcsatornás laboratóriumi munkafolyamatra több minta feldolgozása során.

Milyen paramétereket kell optimalizálni?

Az akusztikus intenzitás, a munkaciklus, a kezelési idő, a ciklusok száma, a szünetidő, a mintatérfogat és a mintahőmérséklet fontos tényezők.

Az első optimalizáció során egyszerre változtass egy fő változót. Ha az intenzitás, időtartam és/vagy sejtkoncentráció egyszerre változik, nehéz lehet megállapítani, hogy az eredmény jobb vagy rosszabb volt-e bármelyik változás miatt.

Teszteljen egy kis állapotmátrixot egy ésszerű kiindulópont körül, és hasonlítsuk össze a fragmentumeloszlásokat és a DNS-visszanyerést

- NEM a legerősebb kezelés, ami a legrövidebb DNS-t eredményezi!

A program kiválasztása után a programot a sejtmérési bemenettel, pufferrel, csővel és mintatérfogattal együtt mentjük el. Ezek nélkül a szonikációs paraméterek nem reprodukálhatók megbízhatóan.

Miért van ez Fontos hogy a mintákat hűtten kell tartani?

Az ultrahangos kezelést hőhatás kíséri, és a kromatin érzékeny lehet a hőre. A fehérjekárosodás, az antitest-felismerés elvesztése és a megnövekedett változatosság a hő tényezői lehetnek.

A hűtés az egész futás során ugyanaznak kell lennie (még a futások közötti pihenőidőben is). A csövek mozgásának sebessége a jégvödör és a műszer között nem befolyásolhatja a mintahőmérsékletet.

Nyírás Minőség Megnézés: Hogyan?

Vágás után vegyél egy reprezentált aliquotot. Fordítsd meg a keresztkötéseket, tisztítsd meg a DNS-t, és értékeld az egész fragmentum méretarány eloszlását agarózel elektroforezisel vagy megfelelő automatizált fragmentumanalizátorral.

Ne értékeld a kezeletlen keresztkötő kromatint, mintha tisztított DNS lenne. A látszólagos méret félrevezető lehet a fehérjék és keresztkötések által okozott migrációváltozás miatt.

Az anyag nagy részének a laboratórium "elfogadott" tartományának határain belül kell lennie, és kevés vagy semmilyen nagy magas molekuláris tömegű anyag populációja hiányzik. A visszanyert DNS mennyiségét is mérni kell, mivel a jó profil nem értékes, ha a DNS nagy része elveszett.

Miért van ott Következetlen Kromatin nyírás?

Ezek a változó fixáció, pontatlan sejtszámok, hiányos lízis, változó mintatérfogat, változó csőtípusok és hőmérséklet-elcsúszás miatt van.

A habzás vagy légbuborékok olyan problémák, amelyek befolyásolhatják az akusztikus kapcsolódást. Ezért a mintacsöveket ugyanúgy kell kitölteni, lefedni és elhelyezni. A módszerfejlesztéshez a validált típusú/validált tételből származó csöveket részesítik előnyben.

Ha eltérés van egy tétel eredményei között, az arra utalhat, hogy minta pozíció hatása vagy a minta előkészítésének időzítése következetlen lehetett. Egy egyszerű futási napló hasznos lehet annak megállapítására, hogy van-e bármilyen eltérés a biológiai, eljárások vagy műszerek vonatkozásában.

Hogyan kell optimalizálni egy új mintatípust?

Kezdj kis rögzítéssel és akusztikus mátrixmal, amely valódi kísérletet reprezentáló anyaggal készít. Ne használj értékes vagy nem pótolható mintát az első teszthez.

Értékelje a fragmentum-eloszlást, valamint a DNS visszanyerését és az immunoprecipitációs teljesítményt. Nyírás után a kromatin alkalmasságát a ChIP-re egy pozitív kontroll antitest és ismert céllokuszok segítségével lehet értékelni.

Optimalizálás után állítsd be a kritikus paramétereket egy SOP-ban. További információkért a kromatin előkészítéshez szükséges fókuszált ultrahangról kérjük, lásd Longlight ChIP alkalmazásoldal.

Következtetés

Nem csak az ultrahangos teljesítményről van szó, hogy megbízható kromatin nyírást érjen el. A fiksálás, a sejtbemenet, a sejtalízis, a mintageometria, valamint az akusztikai és hőmérsékleti feltételek különböző összetevőinek kompatibilisnek kell lenniük.

Az optimális módszer biztosítja a megfelelő fragmentumeloszlást, valamint fenntartja az immunoprecipitációs teljesítményt és az anyag visszanyerését. Minden laboratórium szívesen keresheti a Longlightot a kapcsolatfelvételi oldalon keresztül, hogy információt adjon a mintatípusáról és adagról, valamint a ChIP munkafolyamatról, amelyet használni szeretnének, a berendezések és alkalmazások támogatása érdekében.

GYIK

Q1. Miért van szükség kromatin nyírásra?

Az IP esetén a keresztkötött kromatint kisebb darabokra bontja. A szabályozott méretű fragmentumok használata növeli a ChIP-qPCR és ChIP-seq felbontását.

Q2. Mi történne, ha a kromatin alulnyírva lenne?

Nagyon nagy darabok felbontásvesztést és a nem specifikus háttér növekedését okozhatnak. Fontold meg a fixáció, a lízis és akusztikus állapotok újraértékelését, mielőtt automatikusan meghosszabbítanád a kezelést.

Q3. Lehetséges túlnyírni a kromatint?

Igen. Ha túl sok kezelést alkalmaznak, a regeneráció megromlik, vagy a fehérjeepitópok és DNS-fehérje komplexek sérülnek. Nem mindig jó ötlet rövidebb fragmentumokat használni.

Q4. Szükséges a kromatint-t a szonikáció alatt jégen tartani?

Igen. Az alacsony hőmérsékletű feldolgozás stabil, ami segít csökkenteni a minták és fehérjék hő okozta károsodását. A hőmérsékletnek állandónak kell lennie a minták és adagok között.

Q5. Van egyetlen kromatin – őegyGyűrűprogram, ami minden sejttípusra alkalmazható?

Általában nem. A sejtszerkezet, a kromatin sűrűség, a fixációs válasz és a mintakoncentráció közötti különbség megvan, ezért az új mintatípusokat korlátozott optimalizálásnak kell alávetni.