Mágneses gyöngyelválasztó DNS-kivonáshoz: gyakorlati kiválasztási útmutató

A DNS-kivonás legtöbb figyelme a mágneses gyöngy kémiára irányul. Ugyanakkor a csöveket tartalmazó elválasztó befolyásolhatja a visszanyerést, tisztaságot és az operátor konzisztenciáját is.

A fogási idő és a fogózóna konzisztenciája fontos teljesítménytényezők egy mágneses gyöngyelválasztó esetében, amely szükséges ahhoz, hogy hatékonyan immobilizálja a DNS-hez kötött gyöngyöket anélkül, hogy veszélyeztetné a gyöngyök kiszámítható immobilizációs pozícióját az aspiráció során. Gyenge, szabálytalan és/vagy rosszul látható fogózóna esetén a gyöngyök elveszhetnek a felsőgúnnyal együtt, vagy lebeghetnek a mosópufferben.

Hogyan működik a mágneses gyöngy DNS kivonása?

A mágneses gyöngy-kivonás olyan paramágneses részecskék használatát jelenti, amelyek felülete jól meghatározott kémiai körülmények között köti meg a nukleinsavokat. A lízis után a megfelelő kötési feltételek elősegítik a nukleinsavak adszorpcióját a funkcionalizált mágneses gyöngyökre.

A mágneses tér nyomást gyakorol a gyöngyökre, amelyek a mintaedény aljára vagy falához vezetik őket. A felsőgúnzát akkor pipetálással eltávolítható centrifugáció nélkül. Mielőtt a DNS-t eluciós pufferbe bocsátanák, sókat, fehérjéket és gátlókat mosópufferek mosnak ki belőle.

A szeparátor nem vesz részt a kémiai kötésben. Ennek célja, hogy megbízhatóan immobilizálják a gyöngyöket a szétválasztás és folyadék eltávolítása során. A MSG mágneses állvány a Longlight-tól egy állandó mágnesalapú csőszeparátor, amely nukleinsavokat, fehérjéket és sejteket választ szét.

Miért mágneses-Mező Fontos tervezés?

A szeparátor teljesítménye nem határozható meg kizárólag a mágnes erőssége alapján. A mágnes és a minta közötti távolság, a mágneses tér gradiense, a csőgeometria és a gyöngy tulajdonságai mind befolyásolják a fogás viselkedését.

Egy jó mező koncentrálja a gyöngyöket, hogy egy kis, könnyen látható területet alkossanak. Ez megkönnyíti a felfelsőgúgya eltávolítását anélkül, hogy zavarná a pelletet a pipetta hegyek elhelyezésekor.

Túl agresszív vagy egyenetlen fogási minta kompakt gyöngycsomókat eredményezhet, amelyeket nem könnyű visszahúzni. Egy rossz elkészítés miatt a gyöngyök túl sokáig lógnak. Az ideális cél, hogy gyorsan, alaposan és ismételően szétváljanak anélkül, hogy bonyolítaná a későbbi keverés folyamatát.

Mik Néhány Olyan helyek, ahol elveszhet a DNS?

A gyöngyök leggyakrabban akkor vesznek el, amikor a felszínt eltávolítják és kimosják. Ha a pellet nem látható, a pipetta hegye kimozdíthatja vagy felszívhatja.

A megmaradt folyadékkal a probléma más. A mosópuffer hiányos eltávolítása etanol, sók vagy más összetevők átviteléhez vezethet, ami befolyásolhatja a PCR-t, ligációt vagy könyvtár-előkészítési reakciókat.

Az is fontos, hogy ne szárítsd túl a terméket. A gyöngyök túlszárítása a végső mosás után megnehezítheti a felfüggesztést, és csökkentheti az elució hatékonyságát. A tiszta fogózóna a kezelőt a helyes eltávolításhoz, valamint a megfelelő időben történő következő lépéshez vezeti.

Mi a legjobb Párosítás a Tube formátumra és a hangerőre?

A szeparátornak tartalmaznia kell a protokollban használt tényleges edényeket. Ezek általában PCR csövek, 8 csöves szalagok, 96 lyukas lemezek, 1,5 mL vagy 2,0 mL mikrocentrifuga csövek és nagyobb kúpos csövek formájában jelennek meg.

A cső elhelyezkedése egy rackben túl messze lehet a mágnestől egy másik formátumhoz. A jó igazítás akkor is fontos, ha a cső fizikailag alkalmas rá, mert a rossz igazítás hosszabb szétválasztási időt vagy kényelmetlen helyet okozhat a pelletek elhelyezkedéséhez.

A munkamennyiség is fontos. A Longlight MSG sorozata különféle kis térfogatú formátumokat tartalmaz, a mikroliter mintáktól 2 mL-ig különböző PCR edényekben, valamint szabványos mikrocentrifuga csövekben.

Mi az a Rendben Mennyi áteresztőképesség van?

Egy kutatólabor, amely néhány mintával dolgozik, egy kis, jól látható és könnyen hozzáférhető csövekkel rendelkező állványt szeretne választani. A formátumnak illeszkednie kell a diagnosztikai vagy szekvenáló laboratóriumhoz, valamint a tétel méretéhez és a többcsatornás pipetelési protokollhoz.

Nem feltétlenül probléma, ha nem minden pozíciót használunk, de ha nyolccsöves protokollt alkalmaznak, az egyéni kezelés során eltérő időzítések jelentkezhetnek a minták között. A kiszámítható gyöngyrögzítés minden pozícióban fontos a nagyobb áteresztőképesség érdekében, ahol a cső egyenletes távolsága is fontos.

A Longlight NGS minta előkészítési portfóliója magában foglalja a mágneses szétválasztást, DNS mennyiségesítést, DNS fragmentációt és elektroforézist, így integráltabb munkafolyamatot biztosít a minták előkészítéséhez.

Mosás – Hogyan Meg kell csinálni?

Miután a gyöngyök összegyűltek, tedd a pipettvéget a gyöngyök másik oldalára. Hagyd, hogy a folyadék elég lassan távolítsa el, hogy ne szakadjon le a gyöngyök a mágnesről.

A megadott mosópuffert szabványosított protokoll szerint adjuk hozzá. A munkafolyamattól függően a mosás a csővel is elvégezhető a racken, vagy a gyöngyöket teljesen újra kell felfüggeszteni a mosási lépések között.

A módszernek meg kell mutatnia, hogy a gyöngyöket minden lépés során teljesen szét kell-e oszlatni. A szennyezők csomóba rekedhetnek, ha a visszaszuszpenzió nem teljes, és ha a keverés túl agresszív, nagyobb változást okozhatnak a minták kezelésében.

Hogyan működik a DNS elutált a gyöngyökből?

Miután a végső mosás és a szárítás (kontrollált) befejeződött, vedd ki az edényt a mágneses állványról. Adj hozzá jelölt eluciós puffert, és alaposan felfüggesztsd a gyöngyöket.

A DNS visszanyerését befolyásolhatja a hőmérséklet, az elució térfogata, a keverés és az inkubálás ideje. Az elution befejezése után vissza kell helyezni a csövet a mágneses állványba, és várja meg, amíg a gyöngyök teljesen visszafogódnak, és a felsőgyöngy tiszta lesz, mielőtt áthelyeznénk a DNS-t tartalmazó szupernatánt.

A pellet eluciós pozíciója különösen fontos, ha alacsony térfogatú eluciót használnak. Egy kompakt pellet, amely távolabb van az aspirációs zónától, több eluátot eredményez, de gyöngyök átadása nélkül.

Hogyan lehetne Szeparátor A teljesítményt kell mérni?

Ismételje meg a kivonásokat ugyanazzal a mintával, a gyöngy kémiájával és a kivonást végző személyrel. Jegyzétek fel a szétválasztáshoz szükséges időt, a pelletek láthatóságát, a felsőgyöngy eltávolításának egyszerűségét és a gyöngyök könnyű újrafelfüggesztését.

Ellenőrizd a DNS mennyiségét és minőségét, valamint teszteld azt az alkalmazást, amelyhez használni szeretnéd. Még ha egy minta elfogadható abszorpciós arányú is, a minta tartalmazhat elegendő gátlót ahhoz, hogy befolyásolja a PCR vagy szekvenálási könyvtár előkészítését.

Többcsöves és lemezes pozíciók esetén a pozíciók közötti konzisztencia fontos. Több teszthelyet tesztelj – összehasonlítva az eredményeket a középpontnál és a széleknél.

Mikor szükséges nagyobb biomágneses elválasztó?

A csőállványok mindennapi mikroliteres vagy milliliteres alkalmazásokhoz is használhatók. Több száz milliliter vagy néhány liter reagens, biofeldolgozás vagy gyártás szükségessé válhat.

Nem mintha egy nagyobb mágnes ilyen nagyságrendben változtatna különbséggel. Az edényátmérő, a keveredés, a gyöngy mozgástávolsága, a mező egyenletessége és a folyamat monitorozása jelentősebb.

Longlight's Biomágneses szeparátorok, MSG-250/MSG-1000 modell hasznosak nukleinsavak szétválasztására, fehérjetisztításra és más adagos folyamatokra történő felskálázáshoz.

Vevői ellenőrzőlista.

Ellenőrizd a következőket: a támogatott csőtípusokat, a munkatérfogat tartományt, hány pozíciót foglalnak, és hogy kompatibilis-e az egycsatornás vagy többcsatornás pipettákkal. Nézze meg a gyöngyök helyét, és hogy a pellet még látható-e az üzemeltető normál munkaszögéből.

Kérjen "szétválasztási adatokat" gyöngy és edény formátumban, amely hasonló a protokolljához. Továbbá fontolja meg a tisztítási igényeket, a kémiai ellenállást, a rács stabilitását és a cső egyszerű behelyezését és eltávolítását hirtelen mozdulatok nélkül.

Egy több kötetet magában foglaló termékcsalád megkönnyítheti a laboratóriumi személyzet képzését és a módszerátadást azokban a laboratóriumokban, amelyek több kivonási formátumot használnak. A mágneses elválasztás és más megoldások a Longlight Általános laboratóriumi munkafolyamat-megoldások.

Következtetés

A mosófolyadék eltávolításának pontosságát és a csőben maradt DNS-kötő anyag mennyiségét közvetlenül befolyásolja a mágneses gyöngyelválasztó a DNS-kivonáshoz. A látható pellet és a megfelelő cső elhelyezése nagyobb visszanyerést és jobb ismételhetőséget eredményez az Uniform gyöngyfogással.

A szétválasztót a gyöngykémiával, mintamennyiséggel és folyadékkezelési technikával együtt kell figyelembe venni. A labor felhasználói e-mailben elküldhetik csőformátumukat, adagméretüket és/vagy munkamennyiségüket a Longlightnak Kapcsolatfelvételi oldal Termékpárosításhoz.

GYIK

Q1. A mágneses elválasztó közvetlenül kötődik a DNS-hez, vagy valamilyen más molekulához, amely DNS-hez kötődik?

Nem. A gyöngyöket egy felszíni kémia borítja, amely DNS-hez kötődik. A szeparátor képes megtartani ezeket a gyöngyöket, és eltávolítani a körülöttük lévő folyadékot.

Q2. Van egy-egy mágneses rack minden csőtípushoz?

Általában nem. A munkatérfogatot és a csőgeometriát ellenőrizni kell, mivel a fizikai illeszkedés nem feltétlenül jelenti azt, hogy a mágnestől való távolság megmaradjon.

Q3. Milyen időt kell hagyni a mágneses szétválasztásra?

A gyöngyök tulajdonságaitól, a mintamennyiségtől, a viszkozitástól, a cső alakjától és a mágnesszerkezettől függ. Végezze el a validált protokollt, és várja meg, amíg a felsőgúns tiszta lesz.

4. kérdés. Miért vannak mágneses gyöngyök a végső eluátumban?

Lehet, hogy a beszívás során megzavarta a pelletet, vagy túl rövid a tisztítási idő. Óvatosan helyezd vissza a csövet a mágnesbe, és helyezd át újra a felsőgát.

Q5. Lehetséges az RNS-t mágneses szeparátorokkal kinyerni?

Igen, megfelelő RNS-kötő gyöngykémiával és kivonási eljárással. Ennek ellenére RNáz-kontrollt kell végezni.