Ultragyors elektroforézis puffer: gyorsabb DNS gélek anélkül, hogy elveszítenék a tisztaságot

Bár az agarózel elektroforézis egyszerű és megbízható, a hagyományos elektroforézis ideje néha korlátozó tényező lehet egy forgalmas molekuláris biológiai laboratóriumban. Ha egy laboratórium naponta több PCR reakciót, restrikciós emésztést vagy klónozási mintát futtat, egy 30 perces futás jelentős szűk keresztmetszetet jelenthet, ha naponta több gélet dolgoznak fel.

Egy ultragyors elektroforézis puffert alacsonyabb ionerősséggel alkotnak, ami csökkenti a vezetőképességet és áramot egy adott elektromos térerősségnél, így korlátozza a Joule felmelegedést. Ez lehetővé teszi a nagyobb mezőerősség alkalmazását validált körülmények között, lerövidítve a szétválasztási időt, miközben megőrzi a hasznos sávfelbontást.

Ultra Gyors Electrophoresis Buffer—Mi az?

Az ultragyors elektroforézis puffer egy alacsony ionerősségű elektroforézis puffer, amelyet optimalizáltak a DNS fragmentumok gyors szétválasztására agarozzselekben. Biztosítja az ionokat, amelyek szükségesek az elektromos vezetőképességhez és a kémiai körülményekhez a migráció során.

Ennek a puffernek az ionereje alacsonyabb, mint a legtöbb hagyományos pufferé, így az áram miatt kevesebb hő keletkezik adott működési körülmények között. Ez lehetővé teszi a laboratóriumban nagyobb feszültséggradiens alkalmazását, és lerövidítheti a futási időt.

Longlight's 50-szeres szupergyors futópuffer koncentrált oldatként szolgáltatják, és a javasolt körülmények szerint lerövidíti a szétválasztási időt a tipikus 30 percről körülbelül 5-10 percre.

Ennek oka alsó Az ionikus erő javíthatja a futási sebességet?

A DNS negatív töltéssel rendelkezik, és elektromos térben a pozitív elektród felé vándorol. Minél nagyobb az elektromos tér, annál gyorsabban halad a DNS, azonban a hagyományos pufferok jelentős hőt termelhetnek magas elektromos tér esetén.

A túlmelegedés okozhatja az agaróz olvadását, ami hajlításokhoz, ívelt sávokhoz vagy az elektroforézis berendezésének károsodásához vezethet. Az alacsony ionerősségű puffer kevesebb áramot eredményez; kevesebb hő keletkezik, így magasabb feszültségen is könnyebb működni.

Ez nem jelenti azt, hogy a feszültséget korlátlan ideig lehet emelni. A gellä méretei, a puffer mélysége, a kamra kialakítása, valamint a környezeti hőmérséklet és a tápellátás kapacitása továbbra is befolyásolja a futást.

Gyorsabb lesz Electrophoresis Kevesebb felbontást eredményez?

Ha a puffer, az agaróz koncentrációja, a feszültség és a menet távolsága megfelelő a mintához, gyors futással jó elkülönítést lehet elérni. A feltételeket általában nem ellenőrizik a módszer átadásakor, ami rossz felbontáshoz vezet.

Ahhoz, hogy a töredékek elváljanak, megfelelő migrációs távolságot kell biztosítaniuk, ha méretük közel áll. Ha a futás túl korán megáll, összenyomódhatnak, még akkor is, ha a nyomkövető festék elmozdult a kutak közelében.

Fontos, hogy a laboratóriumok felismerjék a különbséget a jelenlét vagy hiány meghatározásához szükséges elemzés és a nagy felbontású analitikus gél között. Az elsőnek rövidebb gélidő kell, a másodiknak hosszabb zselés idő vagy kissé alacsonyabb feszültség szükséges.

Hogyan készítsünk elő egy 1X működő puffert egy 50X koncentrátumból?

Az 50 X koncentrátot 1X munkaoldattá hígítani kell. Például, hogy 1 liter 1X munkapuffert készítsünk, keverjük össze 20 ml 50X koncentrátot 980 ml desztillált vagy demineralizált vízzel.

Alaposan rázd meg öntés vagy töltés előtt a kamrát. Mind az agarose gel, mind a futó tartály előkészítéséhez ugyanazt az 1X előkészítést használd, hogy fenntartsd a rendszer vezetésének következetét.

Ne hígítsd a puffert a javasolt munkakoncentráció alá az áram további csökkentése érdekében. Gyenge pufferezés és/vagy következetlen sávmintázatok is kialakulhatnak a rossz koncentrációból, ami rendellenes migrációhoz vezethet.

Mi az a Helyes Feszültség beállításához?

A feszültséget az effektív gél hossza határozza meg, nem csupán egy megszokott tápegység beállításából választani. A Longlight körülbelül 25–30 V/cm gélhossz használatát javasolja a gyorsan működő pufferrel együtt.

Azonban a végső beállításnak figyelembe kell vennie az elektroforézis kamrát, valamint a gál típusát és a pufferhőmérsékletet is. A végső feszültségnek figyelembe kell vennie a gellä hosszát, a mintaterhelést, a kamra kialakítását és a pufferhőmérsékletet is.

A tápegységnek stabilnak kell lennie a kívánt beállításon a kimenetelben. A EP-600 elektroforézis tápegység A Longlight által gyártott eszköz stabil elektroforézis tápellátást biztosít a laboratórium számára.

Milyen gála Feltételek Nem változott?

A puffer nem tudja felülmúlni az agarózkoncentráció használatát, amely nem megfelelő. Az agaróz alacsonyabb koncentrációja hajlamos a magasabb molekulatömegű fragmentumokat támogatni, és minél magasabb az agaróz koncentrációja, annál jobb a kisebb DNS-fragmentumok szétválasztása.

A gél vastagsága is fontos. A vastag gélek tovább tarthat a festéshez, és több hővel rendelkeznek. Tisztítsd a kutakat és a minták betöltését anélkül, hogy károsítanád a széleket.

Egy kompatibilis vízszintes kamra lehetővé teszi az elektromos feltételek kiegyenlítését. A HE-50 vízszintes gélrendszer kompatibilis több gél rendszerrel, és alacsony pufferfogyasztású kamra kialakítással rendelkezik.

Milyen festési és vizualizációs módszereket érdemes használni DNS-hez?

A terméktől és protokolltól függően nukleinsav festés is beépíthető a gél elkészítése során, vagy elektroforézis után is alkalmazható. Ha egy gyors puffert hasonlítanak egy meglévő festési módszerrel, a festési módszernek ugyanaznak kell lennie.

A nagyon rövid futások befolyásolhatják a foltos intenzitás érzékelését, különösen, ha a sávok rövid távon futnak. Fontos az expozíció beállítása, ezért a fentiek következtében ne másoljuk le az automatikus expozíciót egy hagyományos futásból.

LongLight's RedView nukleinsav folt használható a DNS és RNS vizualizációjára agarózban és poliakrilamid gélekben, és közös képalkotó eszközökkel működik.

Tényleg lehetséges DNS-t kell gyors lefutás után visszanyerni?

Igen, amíg a puffer és a festék nem befolyásolja a gél kivonását és az alsóáramú reakciókat. A Longlight szerint az 50X Super Fast Running Buffer nem befolyásolja a DNS gél kivonását vagy ligációját.

Minimalizáld a felesleges UV-fény kitettséget, és távolítsd el a lehető legkisebb gélszeletet a legjobb visszanyerés érdekében. A szalagot külön kell tartani, hogy elég elkülönüljön és ne legyen benne a szomszédos termék.

Ha egy módszer validálása klónozás, szekvenálás vagy más érzékeny lefelé irányuló folyamat esetén értékeljük a visszanyert DNS hozamát, tisztaságát és teljesítményét.

Mikor kell váltani a futó puffert?

Néhány puffer újrahasználható, de az újrahasznosítást szabályozni kell, és nem kizárólag a megjelenés alapján. Ismétlődő futások esetén a hőmérséklet, az ioneloszlás és a puffer teljesítménye változhat.

Ha a migráció lassul, a sávok nem a várható alakúak, vagy az oldat szennyeződött, cseréld ki a puffert. Egy másik ok, amiért jó az idő a puffer ellenőrzésére, az a szobahőmérséklet magas, és egymást követő gyorsabb futások után is elérhető.

Ha a minta fontos vagy alacsony a bemenet, ajánlott friss munkapuffer használatát a felesleges változtatások elkerülése érdekében.

Mik a megfelelő lépések a laboratórium számára a Switch validálásához?

Használj ismert DNS-létrát és mintákat. Használd ugyanazt a gál koncentrációt, mintamennyiséget és festési módszert a meglévő pufferen és az ultragyors pufferre, és párhuzamosan futtatd őket.

Egyeztessék be a futási időt, a sáv alakját, a közeli fragmentumok szétválasztását, valamint a migráció konzisztenciáját és képminőségét. Amikor a gél kivonás részt vesz a munkafolyamatban, értékelje a gél kivonásának és egy későbbi reakció hozamát is.

Miután elfogadták, dokumentálják a hígítást, a feszültséggradienst, a gellä méretét, a futás hosszát, a gél színezését, valamint hányszor használták a puffert. Longlight Általános reagensek és fogyókelőanyagok a rendszeres genomikai és molekuláris biológiai alkalmazások elősegítésére tervezték.

Következtetés

Az ultragyors elektroforézis puffer képes az agarózgél elemzést gyors minőségellenőrzésré alakítani. Az előnye, hogy alacsonyabb ionerősséget tesz lehetővé, ugyanakkor magasabb használható elektromos térerősséget is.

Ugyanakkor az 1X előkészítés, a gellä és a futó puffer párosítás, az agarózkoncentráció és a hőmérséklet-szabályozás minden aspektusa továbbra is kulcsfontosságú a megbízható eredmények biztosítása érdekében. A rövid, egymás melletti validálás lehetővé teszi a laboratóriumok számára, hogy lerövidítsék a futási időt anélkül, hogy feláldoznák az értelmezhető sáv szétválasztását.

GYIK

Q1. Használható-e ultragyors elektroforézis puffer DNS-géllel?

Igen. Gyors DNS-szétválasztásra tervezték agarózzélben. A felhasználóknak azt javasoljuk, hogy ellenőrizzék a gélkamra, a festés és a későbbi munkafolyamat kompatibilitását.

Q2. Készen áll az 50X puffer a felhasználásra?

Nem. Az 50X koncentrátut 1X-re hígítani kell a gél előkészítése vagy elektroforézis előtt. A koncentrátum közvetlen használata túl magas ionerősséget és vezetőképességet eredményezne, ami az elektroforézis során túlzott áram- és hőtermeléshez vezet.

Q3. Ugyanazt a puffert használják az öntéshez és a gél futtatásához is?

Igen, ugyanaz az 1X munkapuffer adag ajánlott mindkettőre. Ez segít fenntartani a puffer erősségét a gél rendszerében.

Q4. Felmelegszik a gél, ha a feszültséget növeljük?

Ha nem pufferel megfelelően, akkor a feszültség- vagy kamra feltételei nem megfelelőek. Több futásnál és/vagy meleg laboratóriumok esetén figyeld a puffer hőmérsékletét.

Q5. Lehetséges-e DNS-t visszanyerni egy gyors elektroforetikus szétválasztásból ligációhoz?

Igen, ha megfelelő festéket és puffert használnak. A laboratórium kezdeti validációjának magában kell foglalnia a helyreállítási és ligációs teljesítményt.