Keresztszennyeződés nélkül: Nagy teljesítményű ultrahangszerelő laboratóriumi NGS-hez

A nagy teljesítményű ultrahangmérnöknek laboratóriumi munkafolyamatokhoz két dolgot kell egyszerre biztosítania: a pontos nukleinsav fragmentációját és a minta abszolút integritását. A keresztszennyeződés nehéz probléma a molekuláris biológiai szekvenálás laborok számára. Új generációs szekvenáláshoz (NGS) könyvtárak komponálása, a CHIP-Seq kromatin nyírása, vagy ritka klinikai minták DNS-kivonása során még a minimális mennyiségű idegen nukleinsav is tönkreteheti a modellt.

Plazmid szekvenciák szennyezése és vektorgenomok megzavarása a

a máj az adeno-assszociált vírus génterápiája után | Természetgyógyászat

Ennek a problémának a jelentősége az NGS munkafolyamatokban

A következő generációs szekvenálási technológiák forradalmasították a genomika és klinikai diagnosztika kutatását. Gyors technológiai fejlődésük és szekvenálási képességeik forradalmasították a területet, de a technológiák könnyen működhetnek különböző helyekről származó DNS-rel, és a technológiák érzékenysége pozitív és negatív egyaránt lehet. Az NGS technológiákkal még a nyomok nukleinsav is hamis pozitív eredményeket, megbizonytalan eredményeket vagy akár sikertelen teszteket is eredményezhetnek.

2025-ben egy közzétett tanulmány, amely négy különböző PCR prototokolt vizsgált különböző európai központokból kiadott egy tanulmányt, amely azt állítja, hogy a hepatitis B vírus szekvenciáit 48 és 100 százalékos genom fedezetével mutatták ki mind a négy prototokol negatív kontrollmintáiban. Ez nem statisztikai anomália, hanem egy rendszerszintű kockázat a szennyeződés miatt, amelyet a hagyományos minták előkészítési módszerekkel nem tudnak megszüntetni.

Többféle módja van a keresztszennyeződésnek, például:

• DNS terjedése a levegőben: A nyitott edényeken lévő ultrahangos energia DNS-csepp ködöt termelhet és megzavarhatja a szomszédos mintákat.

• Folyadékmaradványok újrahasználható szondákon: A szondaalapú szonikátorok fizikai kapcsolatot igényelnek, így a teljes fertőtlenítés a futások között kihívást jelent.

• Lemezmanipuláció fröccsenést okoz: A manuális/automatizált áthelyezések lehetőséget adhatnak a minták átvitelére.

• Felületi átvitel: A nem megfelelően tisztított munkafelületek/műszeralkatrészek a szennyeződéseket a jövőbeni futásokra is átjuttatják.

Ezek a kockázatok nőnek azokon a helyeken, ahol naponta tucatnyi vagy száz mintát kell feldolgozni. A következmények még súlyosabbak klinikai környezetben, ahol a keresztfertőzés hamis diagnózist vagy megváltoztatást igényelhet a beteg előírt viselkedésében.

A hagyományos módszerek korlátai

A DNS töredékezésének és sejtfelbomlásának egyik ismert és hagyományos technikája a szondaalapú ultrahangozás. Ebben a technikában egy mintát helyeznek egy edénybe, és egy fém szondahegyet merítenek vízbe.

Bár ez a módszer nagy népszerűséget kap, hajlamos a mintaproba keresztszennyeződését okozni. A mintafeldolgozás során a szondának közvetlenül kell kapcsolatba lépnie a tartályban lévő mintával. A keresztszennyeződés elkerülése érdekében a feldolgozási folyamatok során a szondával összefüggő keresztszennyeződést kezelni kell. Rengeteg lehetőség van arra, hogy a mintafeldolgozás során kihagyják a dolgokat, különösen a viszkózusabb vagy tapadásos minták esetén, illetve elszökött minták keresztszennyeződésével. A szonda segítségével történő mintafeldolgozást kell kezelni. A kopott szondahegyek részecskéket bocsáthatnak le, és minták keresztszennyeződését okozhatják.

A vízfürdő ultrahangzása más problémákat vehet fel. A mintákat úszó állványokba helyezik egy közös vízfürdőben. Bár a szonda nem érinti közvetlenül a mintákat, a fürdővíz keringik az edények között. Amikor egy cső szivárog vagy megreped, a tartalom a fürdőbe szivárog. A tartalom visszaforgathatott a szomszédos mintákba. Ez a folyamat megnehezíti a keresztszennyeződés észlelését, mivel a szivárgó anyag nem kerül át fizikai vagy közvetlen átvitelre.

Hogyan oldja meg a fókuszált ultrahangolás a problémát

Egy nagy teljesítményű ultrahang-készülék laboratóriumi munkafolyamatokhoz, amely fókuszált ultrahang technológiát használ, megváltoztatja a szennyeződés paradigmáját. Az elv egyszerű, mégis erőteljes: ultrahangos érintkezés külső forrásból származik, de az érintkezés a folyadékközegen keresztül történik, és közvetlenül a mintatartályhoz vezet. A mintát egy teljesen lezárt, egyszer használatos tartályban/csőben tárolják a feldolgozási ciklus során.

A Longlight Technology BoFU-1600 fókuszált ultrahangátora ezen érintkezésmentes feldolgozási paradigma köré épül. A műszer fókuszált akusztikus energiát használ, hogy nagyfrekvenciás, rövidhullámú hanghullámokat koncentráljon közvetlenül a mintazónára. Mivel nincs szonda, amely érintkezne a mintával, és nincs közös fürdővíz, amely a csövek között keringhetne, a szennyeződés vektorokat eltávolítják, mielőtt előfordulnának.

Íme, hogyan ad a kontaktus nélküli feldolgozás tisztább, megbízhatóbb eredményeket:

• Zárt edény integritás: A minták a kezdetektől a végéig zárt centrifuga csövekben maradnak. Nincs út, ahol idegen DNS bejutna a reakcióedénybe

• Nincs aeroszol képződés: Mivel a cső zárt marad, az ultrahangos kavitáció zárt környezetben történik. Aeroszolizált cseppek nem szöknek ki, így a szomszédos minták vagy felületek szennyeződnek maradnak.

• Nincs szondával kapcsolatos átvitel. Nincsenek szpondanyagok, mert nincsenek tisztító/sterilizálandó szondák.

A futások között érintetlenül, és minden mintát külön csőben tartok, így nem szállítják át az anyagokat.

A Covaris S220 fókuszált ultrahangátor olyan technológiát használ, amely nem generál aeroszolokat, és nem igényel kontakt-tételes feldolgozást a szennyeződés megelőzése érdekében. A vezető NGS munkafolyamat automatizálási platformok integrálják a fókuszált ultrahangzást, csökkentve a nyírói lépéseket akár 80%-kal, az NGS könyvtár előkészítési idejét 30%-kal csökkentve, valamint csökkentik a szennyeződés kockázatát.

Pragmatikus hozzáállás a kortárs laboratóriumok igényeire

A BoFU-1600-at olyan technológia alkalmazásával fejlesztették ki, amely megfelel a kortárs genomikai laborok valóságának. Ez a rendszer tartalmazza a szabad feldolgozási módot, amely lehetővé teszi az operátor számára, hogy függetlenül állítson be a feldolgozási paramétereket akár tizenhat mintára, valamint a köteses feldolgozási módot, amely lehetővé teszi az operátor számára, hogy azonos mintákat dolgozzon fel egyetlen akcióval.

A mintaultrahangolás során fenntartott nagy pontosságú hőmérséklet-szabályozó rendszer jelentősen csökkentette a termikus szabályozó tényezők miatt a mintázott albzatokban keletkező artefaktumok kockázatát. A hő által okozott drámai változások a változékonyság vagy akár valódi jelek illúzióját keltheti, és végső soron a kutatók által keresett jelek elhomályosodásához vezethetnek. Ezek a leletek költséges és időigényes kutatási zsákutcákhoz vezethetik a kutatókat.

A hangszer csendes, nincs szükség hangszigetelésre, és beépített operációs rendszerrel rendelkezik, amely önállóan működik külső számítógép nélkül. További jellemzők közé tartozik a passzív vízelvezetés vízszint-ellenőrzéssel a túlfolyás megelőzése érdekében. Az információtárolás bármely kívánt időpontban segíti a minőségellenőrzési folyamatokat, valamint a módszerek helyszínek és laborok közötti áthelyezését.

A piaci igényekre való reagálás

A globális fókuszált ultrahangú DNS-vágás piac 2025 és 2031 közötti vegyületes éves növekedése (CAGR) 5,5 százalék. A DNS-vágásra célozott fókuszált ultrahang-készülék piaci várható eladásai 2025-ben és 2031-ben 731 millió USD lesz. Ez az iparág és a közösség számára azt jelzi, hogy a hagyományos mintaelőkészítés módszere elavult, és nem elégíti ki a genomika reprodukálhatósági és szabványosítási igényeit. A szennyeződés elleni kontroll az ultrahangátor szabványa, ezért a reprodukálhatóság, precizitás és fertőzés proliferációs szabadon kivágott DNS technológia iránti igény várhatóan nőni fog a genomika, precíziós orvoslás és szintetikus biológia elterjedésével.

Záró szavak

A laboratóriumi ultrahangátor magasabb haszonkulcsot kínál, ezért előnyös lesz a genomikai laboroknak, mivel segíti a minták keresztszennyeződését. A nem érintkezési fokú ultrahangzás a szennyeződést a forrásánál kezeli azáltal, hogy mintákat zárva tart, megszünteti az aeroszol keletkezését, és teljesen eltávolítja a fizikai érintkezési útvonalakat. A Longlight Technology BoFU-1600 ezt a képességet egy kompakt, csendes és könnyen használható műszerben biztosítja, amely zökkenőmentesen integrálódik az NGS könyvtár előkészítésébe, kromatin nyírásába, mikrobiális lízisbe és az FFPE nukleinsav kivonási protokollaiba.

Ha a szennyeződést eltávolítjuk az egyenletből, a kísérleti eredmények olyanokká válnak, aminek mindig is lenniük kellett: a vizsgált biológia pontos visszatükröződései, nem pedig a minták előkészítési módszerének leleletei.

GYIK

K: Hogyan képes megelőzni a nagy teljesítményű ultrahang laboratóriumban a keresztszennyeződést?

V: Kontaktus nélküli fókuszált ultrahangot alkalmaznak. Zárt, egyszer használatos csöveket használnak mintákhoz, amelyek kizárják a szondaérintkezést, megakadályozzák az aeroszolokat, és megszüntetik a közös fürdővizet.

K: Használható-e a BoFU-1600 a már piacon lévő NGS könyvtárkészítő készletekkel együtt?

V: Teljesen. Körülbelül 150 és 5 kb közötti DNS-fragmentumokat tud előállítani.

K: A BoFU-1600 futtatásához külső számítógépet kell használnom?

V: Határozottan nem. Ez az eszköz beépített számítógéppel rendelkezik, így több szabad helyet ad a padon, és közvetlenebb felhasználási lehetősége van.

K: Lehetséges ugyanazt a futamot különböző mintatípusokkal futtatni?

V: Teljesen. A szabad feldolgozási mód lehetővé teszi, hogy 1-től 16-ig különböző ultrahangparaméterekkel dolgozz fel minden mintához, és rugalmas a különböző mintatípusok számára is.

K: Mi a szonikátor hőmérsékletének szabályozásának folyamata?

V: Van egy rendkívül érzékeny hőmérsékletérzékelő alrendszer.