RNS kivonási szonikátor: Reprodukálható proteomikai adatok továbbítása hőkárosodás nélkül

A proteomika kutatói egy tartós mintakészítési problémával néznek szembe: ugyanaz a hő, amely segít a sejtek széttörésében, csendben tönkreteszi az általuk gyűjtött adatokat is. Egy jól megtervezett RNS Extraction Sonicator valódi, alacsony hőmérsékletre fókuszált ultrahangtechnológiával, közvetlenül kezeli ezt a konfliktust.

Egyszálú DNS-könyvtárak manuális és automatizált előkészítése

a DNS szekvenálása ősi biológiai maradványokból és más, erősen lebomlott DNS-forrásokból

A szonikáció során zajló kontrollálatlan hő nemcsak a biomolekulákat bontja le – rendszerszinten csökkenti a mennyiségi összehasonlíthatóságot a replikátorok, operátorok és műszerek között. A minták megszakadása jelzi a reprodukálható proteomikaadatok felé vezető út kezdetét. Ez az út sem kiváló tömegspektrométereket, sem bonyolult szoftvereket nem igényel.

Miért akadályozza a hő a proteomika reprodukálhatóságát

Sok fürdő- és zondaszonikus szonikátor gyártója nem a proteomika szem előtt tartva tervezte őket. A szonikátorok és azok caviatitonáramlatainak mechanizmusai mikro-közegű hőcsúcsokat hoznak létre. Általában ez hőmérséklet-ugrásokhoz vezet, és ennek következtében a fehérje denaturációjához vezet. Ez a denaturáció felgyorsítja a proteázok és nukleázok aktivitását, és lefelé irányuló torzításokat hoz létre a fragmentációban. Ez a gyors hőinstabilitás miatt a szonikátorok előnyben részesítik a bőséges, termostabil fehérjéket, és szisztematikus módon csökkentik az alacsony mennyiségű vagy hőérzékeny célpontok észlelését. Ez megzavarja az eredmények mennyiségi integritását.

Az itt felvetett problémák nem tisztán hipotetikusak:

• A mintakészítés az alapkőzet: a laboratóriumi buborékszonikátorok és más, hőmérséklet-szabályozatlan zavaró berendezések nem olyan hasznosak, ha csak a lízis állapotokat tudjuk szabályozni, hogy csak torzításokat hozzanak létre.

• A nagy felbontású tömegspektrométerek értéke lényegében nulla, amikor a proteomika munkafolyamataiban bevezetik a reprodukálhatóságot.

• Amikor a töredezettség feltételei változnak, a műszerek elsodródási jelei és a csúcsok csökkennek, a biológiai felfedezés eredményei romlanak, és a hibakeresés válik a fókuszba, nem pedig a válaszokra.

Fókuszált ultrahang alternatíva

Egy RNS Extraction Sonicator, amely a fókuszált ultrahang kialakítást használja, jelentős előnyöket kínál a hagyományos szonda- vagy vízfürdőrendszerekkel szemben a proteomikai munkafolyamatokhoz. Ellentétben a vízfürdő szondarendszerekkel, amelyek vízzel és akusztikus energiával árasztják el a mintát, vagy közvetlen érintkezést teremtenek a mintával, a fókuszált rendszerek nagyfrekvenciás, rövid hullámhosszú ultrahangot és érintésmentes, izotermikus vízközeget használnak, amelyek az ultrahang energiáját a mintaedényre összpontosítják.

Proteomikai munkafolyamatok esetén ennek a tervnek a következő előnyei vannak:

• Csökkenti a szondával való érintkezésből eredő változékonyságot. A szondahegy behelyezésének, igazításának és eróziójának mélysége már nem befolyásolja, mennyi energiát szív fel a minta. Ez megszünteti a operátorok közötti és futások közötti beállítások fontos változatosságának forrását.

• Az alacsony hőmérsékletű stabilitás megőriz a mintánál. Egy szigetelő közeg fókuszál az ultrahang területén a mintaterületen, és egy finom hőmérséklet-visszacsatolási hurok megakadályozza, és figyeli a minta területét a túlmelegedés és a nukleinsavak károsodásától, valamint megakadályozza a fehérje denaturációját a túlmelegedés miatt.

Fókuszált megközelítés, kutatással alátámasztva

Sok mindent megerősíthet az irodalomban. Példaként a fókuszált ultrahangozást a Nature Protocols (2010) című műben említik, és további példaként Meyer és Kircher leírták, hogyan lehet fókuszált ultrahangzást használni a hőkiadó torzításának és a könyvtár összetettségének szabályozására akusztikus fókuszgeometriát és szabályozott hőmérsékleti környezetet biztosítva multiplexelt szekvenáláshoz rövid és szoros DNS-fragmentumok esetén. A MALDI-TOF-ra fókuszáló proteomikai kutatásokban fókuszált ultrahangos technikát alkalmaztak a filamentos gombák azonosítására kevesebb mint 5 perc működési időben, és megőrizték fehérjekivonási hatékonyságukat.

RNáz H-függő PCR-alapú T-sejt receptor szekvenálás

rendkívül specifikus és hatékony célzott szekvenálás a T-sejt receptor mRNS-nek egysejtes és repertoár-elemzéshez

Nagyobb léptékben a proteomika minták előkészítését fontos elemként ismerték el az adatok minőségében és reprodukálhatóságában a területen. Akár klinikai szérummal, friss szövetekkel vagy nehezen lízálható mikroorganizmusokkal dolgozunk, az elv igaz: a kontrollált, következetes zavarás előfeltétele a jelentős mennyiségi proteomika.

Reprodukálható proteomika építése az irányítás alapján

A fehérjekivonástól a peptid azonosításig történő átültetés minden szakaszban a változók – hőmérséklet, energiakitett kitettség, minta kezelés – szabályozásán múlik. Egy RNS kivonási szonikátor, amely érintésmentes, izotermális, fókuszált akusztikus energiát biztosít, két történelmileg ellenőrizetlen változót távolít el: a hőlebomlást és az operátortól függő energia leadását.

Amikor a mintákat valódi alacsony hőmérsékletű körülmények között dolgozzák fel:

• A fehérje konformációja megőrizik, minimalizálva az artefaktális lebomlást, és biztosítva, hogy a kinyert proteom pontosan tükrözze a minta biológiai állapotát.

•Az enzimatikus emésztési lépések következetes kiindulópontból indulnak, csökkentve a peptidszintű eltéréseket, amelyek egyébként bonyolítják a mennyiségalkotást.

• Az alsóáramú tömegspektrometriai adatok alacsonyabb eltérési együtthatót mutatnak a replikációk között, ami magabiztos azonosítást támogat mind a magas mennyiségű, mind alacsony mennyiségű célok azonosítását.

A modern proteomika igényeinek kielégítése

Hosszú fény technológia's BoFU-80 fókuszált ultrahangátor egy saját, konfokális ultrahangos transzduktor köré épül, amely pontosan koncentrálja az akusztikus energiát a mintára egy izotermális, érintkezésmentes vízfürdőn keresztül, megvédve a biomolekulákat a hőfeszültségtől a szonikálás folyamata során. A rendszert teljes kalibráció van a szállítás előtt, hogy egyenletes teljesítményt biztosítson, és egy rendkívül érzékeny hőmérséklet-szabályozó rendszer ellenőrzi, hogy a minták nem érintettek a véletlen hőtermeléstől, jelentősen csökkentve a kézi használat során keletkező hibákat.

Az eszköz a proteomikai kutatások különböző területeit segíti:

• Sejt-zavarás és fehérjekivonás, hogy elérjük a bőséges és alacsony mennyiségű mikroskálmú célpontokat.

• FFPE minták feldolgozása proteomikai vizsgálatokhoz.

• Szilárd és összetett mintamátrixok homogenizálása.

• Minták előkészítése MALDI-TOF MS számára a mikrobák és klinikai mikrobák azonosítására.

Következtetés

A proteomika területén a reprodukálhatóság a mintakészítés különböző választásaival függ, nem pedig absztrakttal, és a konzisztencia a minták előkészítésével is megvalósítható. Egy RNS kivonásos szonikátor, amely irányított és fókuszos, hőmérséklet-szabályozott, ultrahangos, mérnöki konzisztenciával rendelkezik. A mintafeldolgozás már nem terh, és a következetességet a változékonyság váltja fel. Olyan környezetekben – klinikai diagnosztika, gyógyszerfejlesztés vagy alapkutatás – ahol minden replikáció számít, ez a kontroll nem csupán kényelmes; ez elengedhetetlen.

Gyakori kérdések

K: Milyen intézkedéseket alkalmaznak annak érdekében, hogy megvédjék a mintát a túlmelegedés közben egy RNS Extraction Sonicatorban történő feldolgozás során?

V: A szonikátor fókuszált ultrahangzást alkalmaz, hogy izotróp kapcsolatot teremtsen a minta és a túlmelegedés okozta károsodás között.

K: Ugyanazt az RNS Extraction Sonicatort használják mind a proteomika, mind a genomikai munkafolyamatokban?

V: Igen, a szonikátor mind proteomikai, mind genomikai munkamenetekben működik.

K: Milyen típusú mintákat optimalizálnak az alacsony hőmérsékletű fókuszált ultrahangátor használatával?

V: Alacsony hőmérsékletű fókuszált ultrahangos készülék leginkább azoknak a mintátípusoknak felel meg, amelyek hőérzékenyek, alacsony bőségűek, vagy nehezen idézhetők/lízihetők, például mikroorganizmusok és FFPE szövetek.

K: Mi a hiányosság a fókuszált ultrahangzásban a klinikusok laborában?

V: A fókuszált ultrahangos rendszerek valóban jelentős változatossággal rendelkeznek, különösen a hagyományos szondaszonikátorokhoz képest, amelyek nagyban támaszkodnak a felhasználói bemenetre.