Horizontális gélelektroforézis plazmid DNS-hez: a szupertekercses, bevágott és lineáris formák szétválasztása

A DNS elektroforézis széles körben használt módszer a molekuláris biológiában. Az egyik alkalmazás, amelyhez a legmagasabb szintű szétválasztás szükséges, a három fő topológiai PLAZM-DNS formájának meghatározása, amelyek a szupertekercs, a nyílt kör alakú (bevágott) és a lineáris formák. Bemutatjuk, hogyan kínál az új HE-50 vízszintes gél rendszer plazmid izolációt és minőségellenőrzést, amely nagyobb szétválasztást és reprodukálhatóságot tesz lehetővé.

[Öt szempont a nukleinsav-gél elektroforézis folyamatához | Thermo Fisher Scientific - USA]

Plazmid topológia: három forma

A plazmid DNS nem egyenletes, és három topológiai izoforma keveréke. Az izoláció kontextusában ezek a formák eltérő migrációs sebességet eredményeznek a DNS elektroforézisében.

•Supercoiled (SC) forma: A szupertekercsű plazmidokat az agarose gélben a leggyorsabban vándorló fajnak tartják.

•Vágásos (nyitott körös/oc) alak: A plazmid DNS-ének körkör alakú elrendezése, amelynek egyetlen szála törik, most lazít, így bevágott. Nagyobb effektív méret miatt ez az izoforma lassabban vándorol, mint a supertekercsű DNS.

•Lineáris forma: A plazmid mindkét kovalent szálának megtörése lineáris DNS-t eredményez. Ez a plazmid DNS forma rúd alakú szerkezetű, és a mozgása lassabb, mint a feltekeredt, de gyorsabb, mint a bevágott.

A plazmid elleni oltóanyagok gyártásához használt plazmid DNS minőségének elemzésekor a legfőbb szabályozó hatóságok előírják, hogy a készítmény legalább a szupertekercs plazmid 80%-át tartalmazza.

A plazmidtopológia jelentősége a kutatásban és a biofarmikában

A plazmid DNS-ben az izoformák formája számos tényezőt befolyásol a vakcinával kapcsolatos kapcsolódó folyamatokban:

• Transfekció emlős sejtekre: A plazmid DNS szupertekeredt formája a leghatékonyabb az emlőssejtek transzfekciójában a laza és lineáris formákhoz képest.

• mRNS vakcina előállítása: Az in vitro transzkripcióhoz (IVT) linearizált plazmid sablonok szükségessége nyitott, kör alakú plazmid szennyeződéseket eredményez, ami befolyásolja a hozamot és az állaglást.

• Génterápiás vektorgyártás: A magas minőségű szupertekercsű plazmidok elengedhetetlenek az adeno-assosiált vektorok (AAV) előállításához.

• Stabilitási monitorozás: A tárolási feltételek és a tárolás időtartama befolyásolja a plazmid stabilitását, ahogy a bevágott vagy lineáris formák gyakorisága nő.

Legutóbbi kutatási előrelépések a plazmid DNS elemzésében

Két friss tanulmány hangsúlyozza a plazmid DNS nagy felbontású szétválasztásának jelentőségét:

1. ZorE által közvetített plazmid bevágása (2025)

Egy tanulmány, amely a Nature Communications-ban (2025 március) megjelent, a baktériumi védelmi rendszerekre irányult, és bemutatta a plazmid topológiáinak kontrollját. A Zorya Intézet kutatócsoportja egy lassú átalakulást írt le a szupertekercsű pSG483 plazmid DNS-ből a ZorE fehérje által bevágott és lineáris formáivá. Ezt fokozatos folyamatnak minősítették, és az átalakulást kvantitatív módon ImageJ segítségével elemezték denzitometrikus vizsgálat elvégzéséhez. Megfigyelték, hogy a szupertekercsű plazmidokat fokozatosan bevágta a ZorE (768 nM) 60 perces inkubáció után, 37 °C-on.

[ZorE-közvetített plazmid vágás (2025)]

*"A reakciót EDTA és SDS hozzáadásával állították meg, majd a termékeket gélelektroforázissal szétválasztották egy 1× TAE pufferben, 1,4% agarózzélben, majd eb-vel festették meg."* — Nature Communications, 2025

Ez a felfedezés kritikus a DNS-fragmentum és fehérje kölcsönhatású vizsgálatok szempontjából, amelyeket gélrendszerekkel végeztek.

2. Nem B DNS és DNS-javító fehérjék (2025)

Az NIH 2025 januári PNAS kiadványa kimutatta, hogy a dinukleotid ismétlések behelyezése a pUC18 plazmidokba cis-hatást gyakorol a mismatch javító fehérjék (Mlh1-Pms1) kötődésére. Az EMSA-k 25 nM-től 400 nM-ig terjedő koncentrációban tesztelték a fehérjekötést mind a szupertekercslés, mind a lineáris DNS-ben. A nem B forma DNS megzavarja a fehérjejavítási funkciókat, és hozzájárul a DNS instabilitásának megértéséhez.

[Nem B DNS és DNS javító fehérjék (2025)]

Fontos szempontok a plazmid DNS elektroforézisében

A plazmid DNS elektroforézisében az elektroforotikus felbontás optimalizálása kritikus.

HE-50 vízszintes gél rendszer: A választott rendszer

A HE-50 vízszintes gél rendszer a Longlight Technology-tól, egységes kialakítást alkalmaz, amely előnyös a plazmid DNS elektroforézisében.

1. Magas minőségű szétválasztás

•99,95% tiszta platina-elektródák: kritikus tervezési elem a bevágott izoformákból származó szupertekercs felbontására.

• Rugalmas zselés formátum: A kutatók választhatnak gél méreteket a négy elérhető tálcaméret bármelyikével: 60×60 mm, 60×120 mm, 120×60 mm és 120×120 mm. A legnagyobb méret elég hosszú migrációs távolságot biztosít ahhoz, hogy magasabb felbontással vizualizálható közel mozgó izoformákat.

2. Felhasználóközpontú tervezés

• Irányított betöltőtálca fekete háttérrel: A sötét háttérrel ellátott fluoreszkáló vonalzó lehetővé teszi a pipetta végének gondos igazítását a kutatokhoz, amikor több mintát is betöltenek közvetlen összehasonlításhoz.

• Nagy átlátszóságú polikarbonát tartály: A beépített tartály nagy láthatóságú kialakítása a festék elhomlatának és az elektroforézis folyamatának migrációját mutatja anélkül, hogy ki kellene nyitni a tartályt és megszakítani a rendszert.

3. Biztonság és hatékonyság

• Automatikus lezáró fedél: Egy biztonsági kapcsoló leállítja az áramot, amikor a fedél kinyitásra kerül, hogy kizárja az elektromos áramütés veszélyét, miközben a felhasználók mintákat töltenek vagy eltávolítják a zselatint.

• Alacsony pufferfogyasztás: Az alsó migrációs kamra olyan hídtervezést tartalmaz, amely kevesebb puffert használ, miközben elegendő ionkörnyezetet biztosít a következetes és megbízható DNS-elektroforézishez.

A plazmid izoformák elemzésének lépései

A plazmid DNS optimális szétválasztásához a HE-50 rendszer segítségével:

• Készítsd el az Agarose Gélt: Válassz ki bármelyik tálca méretét, hogy 0,8-1,0%-os agarose gélt önts. Elemzed 3 - 10 kb közötti plazmidokat 1× TAE pufferelt agarózsel.

• Mintakészítés: Kombináljuk a plazmid DNS-mintákat a töltőfestékkel. Használj 200-500 ng plazmid DNS-t. A festékminták aránya: a terheléses festék lehet 1:6, 1:3 vagy 1:1,5. Pipettel töltsd be a plazmidfestékmintákat az agaróz kutakba.

• Elektroforézis: Egy 120 x 120 mm méretű gélt 100 V-on kell futtatni. 100 x 100 mm-es gélekhez használj 80V-ot. A bromofenol kék 45-60 percig működhet. Az elektroforézis akkor áll meg, amikor a festék eléri a talaj kétharmadát.

• Vizualizálás és dokumentálás: Az exponált, átlátszó borítás lehetővé teszi, hogy a gélt UV-vel és képezzen, amíg a borítás még a helyén van. Ha molekuláris vonalzó jelen van, pozitív fluoreszcencia figyelhető meg.

• Quantify Isoform Distribution: Automatizált géldokumentációs rendszerek számszerűsítik a sáv intenzitását. A szupertekercsű DNS százalékát a következők határozzák meg: [SC intenzitás] / (SC OC lineáris intenzitás) × 100.

Akadálytalan munkafolyamat-integráció

A HE-50 rendszert akadálytalan integrációra tervezték a meglévő laboratóriumi munkafolyamatokba:

• Tápegység integráció: A szükséges 4 mm-es banándugók kompatibilisek a legtöbb elektroforézis tápegységgel (állandó feszültséget ajánlunk).

• Képalkotó rendszer integráció: Az UV-átlátszó fedél kompatibilis a szabványos géldokumentációs képalkotó rendszerekkel, így nincs szükség a gélek áthelyezésére tartályokból a képalkotókra.

• Protokoll elfogadása: A rendszer kompatibilis minden szabványos agarózel-gál koncentrációval és elektroforézis pufferekkel (TAE, TBE, SB), lehetővé téve a korábban közzétett plazmid-elemzési protokollok alkalmazását.

Következtetés

A DNS elektroforézis a legegyszerűbb és legnépszerűbb módszer a plazmid DNS minőségének értékelésére. A kutatók felhasználhatják a szupertekercslés, bevágott és lineáris izoformák migrációjáról szerzett tudásukat a szétválasztás optimalizálására és az eredmények értelmezésére. A HE-50 Horizontális Gél System biztosítja azokat a képességeket — tiszta platina elektródákat, választható gélméreteket, terhelési útmutatókat és vezérlőket — amelyek elengedhetetlenek a rutin plazmidelemzéshez. Ahogy a Nature Communications (2025) és az NIH (2025) is kijelenti, az agarózgél elektroforézis az egyik alapvető módszer a DNS és fehérjék kölcsönhatásainak, valamint a DNS topológiájának vagy szerkezetének elemzésére.

A HE-50 vízszintes gél rendszer képes teljesen integrált és moduláris képalkotó rendszerekre; így több lehetőséget biztosít az ügyfeleknek az olcsó plazmid DNS képalkotó rendszerekhez. További információért kérjük, küldjön ajánlatkérést a Longlight Technology cégnek.

GYIK

1. kérdés. Képes a vízszintes gélelektroforézis azonosítani a szupertekercs és bevágott plazmid DNS-t?

A HE-50 rendszer képes azonosítani a szupertekercses, bevágott és lineáris DNS plazmidokat, amennyiben elérjük az elektromos tér egyenletességét, és 0,8-1,2%-os agarózzéleket használnak.

K2. Milyen különböző migrációs sebességek vannak a különböző plazmidformák között elektroforézis során?

Mivel a plazmid szerkezetileg eltérnek, elektroforázis esetén eltérő migrációs sebességet mutatnak. Például a lineáris plazmid formái gyorsabban vándorolnak, mint a kör alakú formák. A lineáris formában a DNS mérsékelt migrációs sebességgel rendelkezik, míg a bevágott vagy nyílt kör alakú DNS a leglassabb migrációs sebességgel.

K3. A szupertekercsű DNS hány százaléka számít magas minőségűnek transzfekcióhoz?

A plazmid DNS-ének egy 80% feletti szupertekercsű formája általában magas minőségű plazmid készítménynek számít transzfekcióhoz és génterápiához.

4. kérdés. Használhatok TAE puffert a TBE helyett a plazmid izoformák szétválasztására?

Igen, a legtöbb esetben TAE puffer használható plazmidelemzéshez. Ugyanakkor a TBE puffer optimális a plazmid izoformák szétválasztására, ha a különbségek minimálisak, és hosszabb elkülönítéseknél.

K5. Miért mutatnak a plazmidmintáim több sávot a gélen?

A plazmid szupertekercses, bevágott és lineáris formái esetén általában több sávot figyelnek meg. Más sávok rossz emésztés vagy lebomlott DNS és RNS szennyeződés következményei lehetnek.