Ultrahangos DNS fragmentációs rendszer: Mi teszi reprodukálhatóvá a DNS-nyírást?

A DNS feltörése nem nagy ügy.

A lényeg, hogy ezt hasznos és ismételhető töredékeloszlásra bontsuk le, egyik mintáról a másikra, napról napra.

Ezért a genomiai DNS nyírásának képessége nem lehet az egyetlen kritérium az ultrahangos DNS fragmentációs rendszer értékelésére. Ehelyett az a kérdés, hogy egy NGS laboratórium esetében világosan meghatározható-e és elhelyezhető-e a mintát a műszerbe ma, jövő héten, vagy egy másik laboratórium kezébe, miközben mégis áthaladhat-e a könyvtári előkészítés felé anélkül, hogy az egész folyamatot újra kellene gondolni.

Nem önálló szonikációs folyamat, hanem a kontrollált akusztikus fragmentáció a Longlight része DNS/RNS nyírás munkafolyamat, amely az NGS mintaelőkészítésére készült. Ez a különbség hasznos lehet olyan technika megtervezésekor, amelyet a mindennapi labormunkához kell igazítani.

Mindig a Fragment Profilral kezdjük, NE az energia beállításával.

A kísérlet célja nem a hangszer beállítása.

A cél a csőből eltávolított DNS populációja.

Az első hely, ahol a könyvtári munkafolyamattól lefelé elvárható, az a hely, ahol először kezdjük, majd visszafelé haladunk egy akusztikus protokollhoz. Egy olyan beállítást, amely egy DNS-tömbnek hasznos eloszlást generál, nem szabad univerzális protokollként értelmezni más tömbök számára.

Ez különösen kritikus a módszerátvitel esetén. Könnyű egy korábbi kísérletből származó szonikációs programot lemásolni, és úgy tekinteni, hogy a munka végzett. A minta koncentrációja, a mintamennyiség, a DNS állapota, a cső típusa és a feldolgozási előzmény mind a gyakorlati eljárás részei.

Ezért a rendszert a tényleges minta körül kell validálni, nem pedig egy vonzó szám körül, amely a mérő kijelzőn látható.

A DNS a Sonicatorhoz egy múlttal érkezik.

A két csőben található "genomikai DNS" nem feltétlenül egyenlő bemenet.

A tiszta kivonásból származó magas molekulatömegű DNS-t is bevonhatjuk. Egy másik megtapasztalhatta a tárolást, többszörös kezelést vagy tárolás tisztítási folyamatát a fragmentáció kezdete előtt.

Ez azért fontos, mert a nyíró lépés egy középső lépés egy nagyobb lépésben.

A laboratóriumoknak először meg kell határozniuk a szabályozható változókat (mintatérfogat, DNS koncentrációtartománya, tartály típusa, hőmérsékleti állapot és kezelési protokoll), mielőtt optimalizálnák az ultrahangos DNS fragmentációs protokollt. Ha nem, a hiba több lépéssel feljebb is megjelenhet, mint látszólagos műszerprobléma.

Szinte minden fókuszált ultrahang esetén az energia a célpontra kerül.

A hagyományos szonikációs módszer elsősorban arra készteti a kutatókat, hogy figyelembe vegyék az ultrahang mennyiségét. A másik kérdés a fókuszált ultrahangolással kapcsolatban: Hová megy az akusztikus energia?

A Longlight BoFU rendszerei nem követelnek meg egy szondát a biológiai mintába behelyezni, hanem inkább a fókuszált akusztikus energia aspektusait egy akusztikus közegben. Érintkezésmentes feldolgozást és integrált hőmérséklet-szabályozást alkalmaz, BoFU-100 fókuszált ultrahangos készülék úgy tartják, hogy DNS, RNS és kromatin nyírásra, valamint genom fragmentációra tervezték az NGS számára.

Ez a nem érintésű, zárt elrendezés kényelmes a DNS fragmentálásához, mivel a minta nem igényel közvetlen érintkezést a szonikációs szondával. Emellett minimalizálja a minta-kontaktus változókat és a tisztítást, amelyek egyébként a protokollba kerülnének.

Nem feltétlenül "több ultrahang".

Ez inkább kontrollált ultrahang szállítás.

A hőmérséklet a Fragmentációs Módszer része!

A hő könnyen figyelmen kívül hagyható tényező, mert az utolsó szekvenálási fájlban nem külön változó.

A szonikálás során a hőviszonyok azonban a mintafeldolgozási környezet részét képezik. Ha az egyik futásnál eltérő a hőmérséklet-előzmény, akkor a protokollt másképp reprodukálják.

Ezért fontos, hogy a hőmérséklet-kezelést a tervezési folyamat elején, mielőtt az akusztikát használjuk, és nem egy eszközként.

A Longlight fókuszált ultrahangátor tervei alacsony hőmérsékletű, állandó hőmérsékletű mintafeldolgozást és integrált érzékelőt tartalmaznak, amelyek az ultrahangító kezelés során keletkező hő szabályozására szolgálnak.

A módszerfejlesztéshez, vagyis a hőmérséklethez kapcsolódó állapotok rögzítéséhez, ugyanolyan komolyan a szonikációs programhoz is.

Mit jelent az "reprodukálható" az áteresztőképesség esetén?

Ami egy csővel simán megy, az kényelmetlen lesz, ha ebéd előtt 20 vagy 40 minta érkezik.

Tehát akkor inkább áteresztőképességi probléma van.

A minták különböző ideig tarthatók a feldolgozás előtt. A beállításokat többször is beírhatták az operátorok. A példánytípusok között eltérések lehetnek. Egy ilyen munkafolyamat, amelyben sok kézi ismétlődő munka van, akkor is változtatást okozhat, még akkor is, ha maga az akusztikai technológia stabil.

Longlight's BoFU-800 fókuszált ultrahangátor képes 1-8 minta feldolgozására, optimalizálható feltételekkel, valamint olyan adagbeállításokkal, amelyek alkalmazhatók, ha egyszerre több mintát dolgoznak fel.

A BoFU-1600 fókuszált ultrahangos készülék nagyobb tételméretű, 16 mintapozícióval és egyedi vagy adagban történő feldolgozásra alkalmas mintákra tervezték.

A vásárlással kapcsolatos fontos kérdés ez: "Mely rendszerben van a legtöbb pozíció?"

Vagyis "hány mintavétel kerül feldolgozásra valójában együtt, és milyen gyakran igényelnek ezek a minták eltérő protokollokat?"

Nézzük meg az átlagnál nagyobb fragmentumméretet

Egy sikeres DNS-minta nem eredményez sikeres DNS-fragmentációs munkafolyamatot.

Egy validációs futtatásnak nem kell a legtisztább futamnak lennie, de a replikációkat és a csomagokat is átkapja. A tudósoknak mérlegelniük kell, hogy a fragmentumeloszlás továbbra is alkalmas-e, vannak-e szokatlan farok, vagy a fragmentum-eloszlás szélesebb lesz, és hogy a későbbi könyvtár előkészítése következetesen működik-e.

Ez az a pont az is, amikor a laboratóriumnak eldöntenie kell, hogyan ellenőrzik rendszeresen a fragmentumok minőségét.

A minőségellenőrzést csak a módszerfejlesztés során végzik, nem használják rutin feldolgozásra, apró változások felhalmozódnak, mielőtt bárki észlelhetné őket.

A cél nem az, hogy bemutassuk a szonikátor képességét egyszer feldarabolni a DNS-t.

Az ötlet az, hogy egy olyan folyamatot hozzanak létre, amely ismételhető.

Válassz egy hangszert a pad körül, ne a brosúra körül.

Minden labornak megvan a maga korlátozó tényezője.

Egy kis kutatócsoport, amely alkalmanként DNS-, RNS vagy kromatin mintát készít, értékelheti a kis integrált munkafolyamatot. Egy szekvenálási labor, amely egyszerre több mintát végez, jobban érdeklődhet a párhuzamos feldolgozás iránt. Nagyobb áteresztőképességet és ismételhető/követhető beállításokat igényelhet az üzemeltetők között egy maglétesítményen belül.

Ezért nem lehet kizárólag akusztikai technológia alapján a megfelelő rendszert választani.

Longlight saját véleménye szerint Fókuszált ultrahangátor GYIK, ahelyett, hogy csak specifikációt választasz, vegyük figyelembe olyan tényezőket, mint az akusztikai energia-szabályozás, a fragmentumméret konzisztenciája, áteresztőképesség, csőkompatibilitás, karbantartás, szervizköltségvetés és laboratóriumi költségvetés.

Végső ellenőrzés

Mielőtt ultrahangos DNS fragmentációs rendszert beépítenénk a normál NGS előkészítő protokollba, tegyen fel néhány gyakorlati kérdést.

Lehetséges-e a kívánt fragmentumprofil laboratóriumban több mintából is megszerezni? Vannak bemeneti feltételek bevonási feltételek? Szabályozzák a hőmérsékletet? Megfelelő a cső/mintaformátum a protokollhoz? Lehetséges nagyobb áteresztőképességet elérni anélkül, hogy felesleges kézi változtatást alkalmaznánk?

Ha a válaszok nyilvánvalóak, akkor a töredezett genom létrehozásának szonikációs lépése már nem annyira önálló szonikációs lépésről szól, hanem inkább arról, hogy mit kellene mondania: kontrollált átadásról a könyvtári előkészítésbe.

GYIK

1. kérdés. Mi az ultrahangos DNS fragmentációs rendszer?

Mechanikailag kisebb darabokra vágja a DNS-t, irányított akusztikus energiával, hogy munkafolyamatokban használja, beleértve az NGS könyvtár előkészítését is. Ez az energia egy fókuszált rendszeren keresztül továbbítható akusztikus közegen keresztül anélkül, hogy a mintát a szondával érintenénk.

K2. Lehetséges-e az NGS DNS fragmentációja fókuszált ultrahangvizsgálattal?

Igen. A Longlight által közzétett lista szerint az NGS genom fragmentációja az egyik alkalmazás a Longlight BoFU fókuszú ultrahangú rendszereiben. Még mindig vannak protokollfeltételek, amelyeket optimalizálni kell az adott mintára és folyamatra.

K3. A több ultrahangos teljesítmény jobb eredmény?

Nem. A cél nem feltétlenül a maximális akusztikus energia, hanem a reprodukálható fragmentumeloszlás, amelyet további későbbi feldolgozáshoz lehet használni. A beállításoknak a mintaállapottól és protokolltól kell függeniük.

4. kérdés. Miért fontos szabályozni a hőmérsékletet a DNS-nyírás során?

Az ultrahangos folyamat természete az, hogy hő keletkezik, így a hőmérséklet a feldolgozási paraméter lesz. A kontrollált hőviszony fontos ahhoz, hogy a futamok összehasonlítható maradjanak, ha ugyanazzal a fragmentációs módszerrel ismétlődnek.

K5. Melyik áteresztőképességű rendszert válasszam ki?

Kezdjük azzal, hogy figyelembe veszik, hány mintát általában egyszerre feldolgoznak, és hogy a mintákat ugyanazon vagy más feltételek mellett kell feldolgozni. A BoFU-800 1–8 mintafeldolgozást képes befogadni, míg a BoFU-1600 16 mintapozíciót kínál nagyobb munkafolyamatokhoz.